三、分离
目的微生物不纯，需分离纯化。采用简便迅速，有一定准确性的检出方法，提高筛选效率。常用平皿反应法：
纸片培养显色法：浸有指示剂滤纸。
透明圈法：混浊底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸钙等。
变色圈法：直接用显色剂或指示剂。
生长圈法：利用某些具有特殊营养要求的微生物作为工具菌，要分离的微生物能在一般培养条件下生长而合成该营养物而使工具菌能生长，形成生长圈。
抑制圈法：琼脂块培养法。
四、筛选
即进行生产性能测定，确定适合生产要求菌种。
一般初筛、复筛、再复筛，少数几株进行全面考察。
筛选时培养条件确定是关键，培养基组成、通风、pH、温度等应根据菌株性能、产物代谢途径、类似产品的培养条件及前人的工作进行综合考察，慎重选定。
初筛一株一瓶，取其中10-20%复筛，一株3瓶，直至最后3-5株，广泛考察。
（二)自发突变与育种
一、生产育种
二、定向育种
用某一特定环境长期处理某一微生物群体，同时不断地进行移种传代，以达到积累和选择合适的自发突变体的一种古老育种方法。
近年发展代谢类似物的梯度培养皿法。
（三)诱变育种
利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后设法采用简便、快速、高效的筛选方法，从中挑选少数符合目的的突变株，以供生产科研之用。
基本工作步骤：
基本步骤
原种 （出发菌株) → 纯化→斜面→同步培养→离心洗涤→振荡打散→过滤→菌悬液
→诱变处理 → 平板分离 → 斜面 → 斜面→ 斜面 →保藏及扩大试验
（活菌计数) （计数) （变异率)（初筛) （复筛) （再复筛)
一、出发菌株的选择
用作出发菌株有：野生型菌株；生产菌株；经过诱变的菌株。
一般要求生长快，营养要求粗放，发育早，产孢子多，对诱变剂敏感性高，已能积累少量产品或前体物的菌株。
二、菌悬液制备
一般采用单孢子或单细胞悬液。
诱变剂一般只作用与DNA的一条链，发生变异无法反映在当代表型上，只有经过DNA复制和细胞分裂后，才会使表型发生变异，此即表型延迟。
制备菌悬液时要注意生理状态、均一性、细胞浓度、菌悬液介质（生理盐水或缓冲液)。
三、诱变处理
1、常用诱变剂：
物理诱变剂：紫外线（UV)、X射线、r射线、快中子（0.2-10Mev)。
化学诱变剂：硫酸二乙酯DES，甲基磺酸乙酯EMS，亚硝基胍NTG。
总结表
2、诱变剂量：
诱变剂作用：提高突变率；扩大产量变异幅度；使变异朝正变或负变方向移动。
凡是在高诱变率基础上，既能扩大变异幅度，又能使变异移向正变范围的剂量就是合适剂量。图8-21
3、处理方法：
采用复合处理，包括诱变剂先后使用，同时使用和重复使用，提高效果。
表8-8
四、变异菌株的分离和筛选
诱变处理后一般要经过后培养和变异株筛选。
一般将筛选分为初筛和复筛。
初筛重点在于分离培养尽可能多菌株，采用预先设计的相同培养条件，以量为主，准确性其次，减少漏筛机会。
复筛以质为主，反复多次。
高效筛选方案：
寻找利用和创造形态、生理与生产性状间的相关性。
筛选抗生素生产菌时，可采用琼脂块培养法：图8-22
（四)营养缺陷型筛选
基本培养基（MM，[—])：凡能满足某一菌种野生型和原养型菌株营养要求的最低成分的组合培养基。
完全培养基（CM，[+])：在基本培养基中加入一些富含生长因子的物质，以满足该微生物各种营养缺陷型要求。
补充培养基（SM，[X])：在基本培养基中有针对性地加上某一种或几种其自身不能合成的成分，以满足相应营养缺陷型生长的培养基。
营养缺陷型表示：所要求的营养物的头三个字母表示，如bio-，对应的野生型以bio+表示。
一般步骤：
1、诱变处理
2、淘汰野生型：抗生素法、菌丝过滤法。
3、检出缺陷型：方法有
1)夹层培养法：图8-23。
2)限量补充培养法：含微量蛋白胨（0.01%)的[一]上。
3)逐个检出法：分别接种到[—]和[+]上。
4)影印接种法：[+]培养，影印至[—]上。
4、鉴定缺陷型：
1)生长谱法：缺陷型斜面培养后，制成菌悬液涂布于[—]上，平板上划成不同区域，分别加上一种所需测验的营养物，培养观察。
2)组合补充培养基法：菌株较多时用。
营养缺陷型应用
1、标记菌种：代谢途径、杂交、基因重组中。
2、生物测定用菌
3、生产菌株：前体积累。
（五)抗性突变株筛选
1、一次性筛选：在对于出发菌株完全致死的环境中一次性筛选少数抗性突变株。
2、阶梯性筛选：使用浓度梯度与某一空间或时间。
空间—梯度培养皿法：图8-18。
时间—类似于驯化。
4节:基因重组与杂交育种
杂交hybridization：两个性状不同的菌株或变种之间进行细胞结合，遗传物质交换重新组合成新的性状。
基因重组gene recombination：两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合后，形成新遗传型个体的方式。
二者关系
一、原核微生物的基因重组
（一)转化 transformation
概念：受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它组合到自己的基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的现象。
转化后的受体菌，称转化子transformant
DNA—转化因子。
条件：
1、能进行转化的细胞必须是感受态的。即受体菌最易接收外源DNA片段并实现转化的生理状态。
2、DNA一般都是线状双链DNA，不小于5×105D，转化的片段小于107D，平均含15个基因。
转化频率较低，一般0.1~1%。
过程：图8-25
双链DNA结合→酶促分解、形成片段→一条单链降解，一条进入→同源配对、受体相应段切除，交换，杂种DNA→复制、分离、转化子。
图8-26
转化育种：DNA提取，感受态细胞培养和转化。
转染：把噬菌体或其他病毒DNA（RNA)提取出来，用它去感染感受态的宿主细胞，并产生正常噬菌体或病毒后代。
（二)转导transduction
概念：通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象。
U型管实验：两株营养缺陷型LA-22（try-)，溶源性细菌（受体)；LA-2（his-)，敏感菌（供体)；温和性噬菌体P22。结果在LA-22端出现原养型his+try+。原因？
1、普遍转导
噬菌体可误包裹供体菌中任何基因（包括染色体外遗传物质)，并使受体菌实现各种性状的转导。
1)完全普遍转导：
噬菌体误包入供体菌DNA片段，形成完全不含本身DNA的假噬菌体（一种完全缺陷噬菌体)，感染受体菌后，受体不会溶源化，也不会裂解。导入的DNA片段与同源区配对，通过两次交换而重组到受体菌DNA上，形成稳定转导子。
2)流产普遍转导
在获得供体菌DNA片段的受体菌内，如果转导的DNA不能进行重组和复制，其上的基因仅经过转录而得到表达。
此外源DNA能够保持下去，任何时候只有一个细胞含有它。表型上仍 出现供体菌特征，能在选择性培养基上形成微小菌落。
2、局限转导
通过某些部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中的转导现象。
产生机制：不正常切割 图8-30
温和噬菌体整合到细菌DNA特定位点上，诱导裂解时，在插入位点两侧的少数宿主基因会因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上，一起包入噬菌体中，形成部分缺陷噬菌体，无正常噬菌体的溶源性和增殖能力。
Compbell模型
（1)低频转导（LFT)
E. dgal) 频率为10-4--10-6 ，称低频转导。LFT 裂解物在低moil phage 成熟时，产生转导噬菌体（ lcoli k12的 下感染宿主，可得极少量局限转导子。
缺陷噬菌体。l dgal— 带有半乳糖基因的l
（2)高频转导（HFT)
E. coli 。l dgal 的 细胞，几乎同时感染有正常lgal-受体菌用高moi的LFT裂解物进行感染时，则凡感染有
两种噬菌体可同时整合到受体菌DNA dgal。l 和l dgal 所 缺失基因功能，两个噬菌体同时复制，产生裂解物中，大体上含等量l 可补偿l上，使其成为双重溶源菌 ，诱导裂解时，正常 用低moi 的HFT 裂解物感染宿主，可高频率转导。
3、溶源转变 lysogenic conversion
当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体基因整合到宿主基因上，而使后者获得了除免疫性以外新性状的现象，称溶源转变。
与转导本质上不同，噬菌体不携带任何供体菌基因，是完整的，而非缺陷的。
普遍转导与局限转导比较(插入)
（三)接合conjugation
概念：通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA的过程。也称杂交。
基本原理：
细菌、放线菌中都存在接合现象。放线菌中天蓝色链霉菌( Streptomyces coelicolor)研究的最为详细。细菌中，大肠杆菌研究最清楚。
F+ + F- = F+
F因子传递过程—滚环模型：
Hfr + F- = F-
与F-接合时， Hfr染色体在F因子处发生断裂，环状变成线状，转移至 F- 约100分钟，F因子最后转移。转移过程中经常会发生断裂，所以重组频率高，但很少出现F+ 。
转移过程与F因子传递过程基本相同，但进入F- 的单链DNA经双链化后，形成部分合子，然后同源配对，经过两次或以上的交换才能发生重组。
中断杂交实验
Hfr染色体转移有严格的顺序性，实验中可每隔一定时间利用强烈搅拌等措施，中断接合，从而获得呈现不同数量Hfr性状的F- 接合子。
根据在F- 中出现Hfr各种性状的时间早晚，可以画出一幅较完整的环状染色体图。
F` 菌株—Hfr菌株的F因子因不正常切割而脱离染色体时，可形成游离的但带有一小段染色体基因的F因子，称为F`因子。
此带有F`因子的菌株—初生F`菌株。
初生F`+ F- =F`（次生F`菌株)
既获得了F因子，又获得了来自初生F`菌株的若干遗传性状，以这种接合来传递供体菌基因的方式，称F因子转导。（F—duction)
次生F`菌株中，一部分F因子可重新整合到染色体上，恢复成Hfr菌株。
接合育种
育种前所选择的亲本必须具有一定的选择性标记，还必须具有F因子，受体菌无F因子，但必须为F因子可亲和。
1、菌株准备
2、杂交
3、重组体检出
（四)原生质体融合 Protoplast Fusion
通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，又称细胞融合。
