第二节 DNA的损伤及修复
DNA的损伤，《罗纪盛》P428
一些物理化学因子如紫外线、电离辐射和化学诱变剂均可引起DNA损伤，破坏其结构与功能。然而在一定条件下，生物机体能使这种损伤得到修复。
紫外线可使DNA分子中同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体（TT)，两个T以共价键形成环丁烷结构。CT、CC间也可形成少量二聚体（CT、CC)，使复制、转录受阻。
P346图19-22
细胞内具有一系列起修复作用的酶系统，可以除去DNA上的损伤，恢复DNA的双螺旋结构。目前已知有4种酶修复系统：光复活、切除修复、重组修复、SOS反应诱导的修复，后三种不需要光，又称为暗修复。
一、 直接修复
1949年已发现光复活现象，可见光（最有效400nm)可激活光复活酶，此酶能分解由于紫外线形成的嘧啶二聚体。高等哺乳动物没有此酶。
P347 图19-23 紫外线损伤的光复活过程
A 形成嘧啶二聚体 B. 光复合酶结合于损伤部位 C 酶被可见光激活 D. 修复后释放酶
二、 切除修复
P348 图19-24 DNA损伤的切除修复过程
在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除，并以完整的那一条链为模板，合成出切去部分，DNA恢复正常结构。
I、结构缺陷的修复：
（1)核酸内切酶识别DNA损伤部位，在其附近将其切开。
（2)核酸外切酶切除损伤的DNA。
（3)DNA聚合酶修复。
（4)DNA连接酶连接。
图
II、无嘌呤无嘧啶——碱基缺陷或错配——脱碱基（N-糖苷酶)：
甲基磺酸甲酯可使鸟嘌呤第7位氮原子烷基化，活化β—糖苷键，造成脱嘌呤作用；酸也能使DNA脱嘌呤。
DNA复制时，DNA聚合酶对dTTP和dUTP分辨力不高，有少量dUTP掺入DNA链。细胞中的尿嘧啶-N-糖苷酶可以切掉尿嘧啶。腺嘌呤脱氨形成次黄嘌呤时也可以被次黄嘌呤-N-糖苷酶切掉次黄嘌呤。
对于无嘌呤无嘧啶的损伤有两种修复方法：
（1) AP核酸内切酶切开，核酸外切酶切除，DNA聚合酶修复，DNA连接酶连接。
（2) 插入酶插入正确碱基三、 重组修复
P349图19—25重组修复的过程
切除修复发生在DNA复制之前，而当DNA发动复制时尚未修复的损伤部位，可以先复制，再重组修复。
在重组修复过程中，DNA链的损伤并未除去。
重组修复至少需要4种酶组分。
重组基因recA编码一种分子量为40000的蛋白质，它具有交换DNA链的活力。RecA蛋白被认为在DNA重组和重组修复中均起关键作用。
recB、recC基因分别编码核酸外切酶V的两个亚基。
此外，修复合成还需要DNA聚合酶和连接酶。
四、 易错修复和应急反应（SOS反应)
诱导修复是细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的一系列诱导性修复。
SOS反应诱导的修复系统包括避免差错的修复（无差错修复)和倾向差错的修复。
避免差错的修复：SOS反应能诱导光复活切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质的产生，从而加强光复活切除修复和重组修复的能力，这属于避免差错的修复。
倾向差错的修复：SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，可是却带来了高的突变率，这属于倾向差错的修复。
SOS反应是由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的。RecA蛋白不仅在同源重组中起重要作用，而且它也是SOS反应的最初发动因子。在有单链DNA和ATP存在时，RecA蛋白被激活而表现出蛋白水解酶的活力，它能分解λ噬菌体的阻遏蛋白和LexA蛋白。LexA蛋白（22Kd)许多基因的阻遏物，当它被RecA的蛋白水解酶分解后就可以使一系列基因得到表达其中包括紫外线损伤的修复基因uvrA、uvrB、uvrC（分别编码核酸内切酶的亚基)以及recA和lexA基因本身，还有单链结合蛋白基因ssb，与λ噬菌体DNA整合有关的基因himA、与诱变作用有关的基因umuDC，与细胞分裂有关的基因sulA，ruv，和lon，以及一些功能不清楚的基因dinA，B，D，F等。
SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物，它是生物在极为不利的环境中求得生存的一种基本功能。
然而癌变有可能也是通过SOS反应造成的，因为能引起SOS反应的作用剂通常都具有致癌作用，如X-射线，紫外线，烷化剂，黄曲霉素等，而某些不能致癌的诱变剂并不引起SOS反应，如5-溴尿嘧啶。目前，有关致癌物的一些简便检测方法就是根据SOS反应原理而设计的，既测定细菌的SOS反应。
第三节 RNA指导的DNA合成（反转录)
反转录（reverse transcription)：以RNA为模板，合成DNA。与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反。
1970年，Temin 和Baltimore分别从致癌RNA病毒（劳氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒)中发现发反转录酶。
致癌RNA病毒是一大类能引起鸟类、哺乳类等动物白血病、肉瘤以及其它肿瘤的病毒。这类病毒侵染细胞后并不引起细胞死亡，却可以使细胞发生恶性转化。经过改造后可以作为基因治疗的载体。
放线菌素D（抑制以DNA为模板的反应，复制和转录)能抑制致癌RNA病毒的复制，可见致癌RNA病毒的复制过程必然涉及DNA。
Bader 用嘌呤霉素（puromycin)来抑制静止细胞蛋白质的合成，发现这种细胞仍能感染劳氏肉瘤病毒（RSV)，证实反转录酶是由反转录病毒带入细胞的，而不是感染后在宿主细胞中新合成的。
一、 反转录酶
由一个α亚基和一个β亚基组成，含有Zn2+，具有三种酶活力。
（1)RNA指导的DNA聚合酶活力（以RNA为模板，合成一条互补的DNA，形成RNA—DNA杂种分子)。
（2)RNase H酶活力，水解RNA—DNA杂种分子中的RNA，可沿3’→5’和5’→3’两个方向起外切酶作用。
（3)DNA指导的DNA聚合酶活力。
模板：RNA或DNA
以自身病毒类型的RNA为模板时，该酶的反转录活力最大，但是带有适当引物的任何种类的RNA都能作为合成DNA的模板。
引物：RNA或DNA
底物：dNTP
二价阳离子：Mg2+或Mn2+
真核mRNA3’端有polyA，加入oligo dT后，可以作为反转录酶的模板，合成cDNA。
二、 病毒RNA的反转录过程
所有已知的致癌RNA病毒都含有反转录酶，因此被称为反转录病毒（retrovirus)，反转录病毒的复制需要经过一个DNA中间体（前病毒)。
1、 反转录病毒的基因组结构
P353 图19-27
（1) 反转录病毒基因组通常由两条相同的（+)RNA链组成。5’端附近区域以氢键结合在一起，全长7-10Kb。
（2) 每一条RNA链的两端具有相同的序列，形成正向重复序列。
（3) 5’端有帽子结构，3’端有polyA，与真核mRNA相似。
（4) 5’端带有1分子的宿主tRNA，作为反转录时的引物。某些鸟类反转录病毒携带的是tRNAtrp，鼠类是tRNApro
2、 反转录过程。
当致癌RNA病毒侵染宿主细胞时，病毒RNA及反转录酶一起进入宿主细胞，病毒自身带入的反转录酶使RNA反转录成双链DNA。
（1) 以病毒（+)RNA为模板，合成互补的（-)DNA。
（2) 切除RNA—DNA杂种分子中的RNA。
（3) 以（-)DNA链为模板，合成（+)DNA链，最后形成两端带有LTR（长末端重复序列)的双链DNA。
反转录病毒只有整合到宿主染色体DNA后才能被转录，转录产物经拼接可以产生不同的病毒mRNA。LTR（长末端重复序列)对前病毒DNA整合到宿主染色体DNA以及整合后的转录均起着重要作用。
反转录病毒合成的过程：
图
缺口的模板（基因组)RNA，在U3旁生成一个正链DNA的合成RNA的引物，而其余的模板RNA被降解。
正链DNA合成开始，复制。
图
3、 反转录病毒的生活周期
P354 图19-29
（1) 病毒粒子侵染细胞，病毒RNA和反转录酶一起进入细胞。
（2) RNA被反转录成双链DNA（前病毒)，环化，进入细胞核。
（3) 反转录病毒的DNA整合到宿主染色体DNA中。
（4) 前病毒DNA进行复制，转录出功能基因、基因组RNA和病毒蛋白。
（5) 基因组RNA和病毒蛋白在胞质中组装成新病毒粒子，转移到质膜，通过出芽方式释放新病毒粒子。
三、 反转录的生物学意义。
1．反转录酶存在于所有致癌RNA病毒中，它的存在与RNA病毒引起细胞恶性转化有关。
2．艾滋病毒（AIDS)
人类免疫缺陷病毒（HIV)，也是一种反转录病毒，主要感染T4淋巴细胞和B淋巴细胞。病毒粒子直径100nm，球状，粒子外包被两层脂质质膜，膜上有糖蛋白（gp120、gp41)，另有两层衣壳蛋白p24、p18。
HIV基因组由两条单链正链RNA组成，每个链长9.7kb，RNA 5，端有帽子结构，3’端有PolyA，链上结合有反转录酶。
3．乙肝病毒
大蛋白、中蛋白、主蛋白（表面抗原)
核心抗原
双链环状DNA
乙肝病毒与反转录病毒的区别：
P355
4、真核生物正常细胞内也存在反转录过程
真核生物的谈色体基因组中存在为数众多的逆假基因和逆基因。
逆假基因：无启动子和内含子，但有polyA的残基，推测是由mRNA反转录后整合到基因组中去的。
逆基因：具有启动子和转录功能，无内含子。可能是由于mRNA反转录后刚好整合到启动子的下游处，或者是带启动子的RNA序列反转录后整合到基因组中
第四节 DNA合成技术
一、 cDNA合成
1、 cDNA文库的构建
cDNA：以mRNA为模板，用反转录酶合成第一链，去除mRNA，合成的第二链。
cDNA文库是获得真核结构基因的最好方法，成熟的mRNA无内含子。
（1)、 真核mRNA的分离纯化
特点：含量少，不均一，表达具有发育阶段性和组织特异性。
总RNA： rRNA 80~85%
mRNA 1~5%
tRNA及其它小分子RNA 10~15%
不均一：在1~5%的mRNA中，有10000—30000种mRNA。
分离、纯化：
用Oligo dT纤维素柱（亲和层析法)，加入总RNA，高盐洗脱，先流出非mRNA，降低盐浓度，加入Oligo dA竞争，可洗出mRNA 混合物。
免疫法可分离特定的mRNA。
（2)、 cDNA合成（反转录酶)
A. 自身引物法（S1核酸酶降解法)
图
Oligo(dT)15-18个核苷酸
mRNA5’端序列有丢失。
B. 取代合成法（较常用)
图
Oliyo（dT)与mRNA3’端AAA杂交作为引物，合成第一条DNA链。
RNaseH在mRNA上产生多个切口。
DNA pol.Ⅰ切口平移，DNA ligase连接，合成出第二条DNA链。
T4DNA pol.切去端头的RNA-DNA杂交链。
C. 引物合成法
可以合成全长cDNA，mRNA的5’端不丢失。
图
（3)、 cDNA与载体连接
（4)、 重组体的转化
（5)、 扩增、保存
2、 获取特定mRNA的cDNA
（1)免疫法分离特定的mRNA
（2)PCR法
二、 PCR技术（聚合酶链式反应)
Polymerase chain Reaction
以目的基因或DNA片段为模板，在引物介导及Taq DNA聚合酶催化下，在体外用核苷酸大量合成目的基因或DNA片段。
它能快速、专一地扩增所希望得到的目的基因或DNA片段。
1、 反应物
（1)模板
单、双链DNA或cDNA都可以作为PCR的模板，若以RNA为起始材料，则须经反转录，获得第一条cDNA后才能用于PCR。
（2)Taq DNA聚合酶
DNA聚合酶是进行PCR扩增的关键，从水生栖热菌（Thermus aquaticns VT-1)分离出来。
Taq DNA聚合酶有很好的热稳定性，92.5℃处理130min，仍保留50%的酶活性，在74℃活性最高，错误掺入核苷酸的比率为1/7500。
（3)引物
引物是决定PCR结果的关键，它由寡核苷酸组成，15-30个b
（4)核苷酸dNTP
dNTP的浓度50-200umul/L。
（5)镁离子Mg2+
2、 PCR原理
图
变性 95℃
复性 55℃
延伸 72℃
第十四章 RNA的生物合成
RNA的生物合成包括转录和RNA的复制。
转录（transcription)：以一段DNA的遗传信息为模板，在RNA聚合酶作用下，合成出对应的RNA的过程，或在DNA指导下合成RNA。
转录产物：mRNA 、rRNA、 tRNA、小RNA
除某些病毒基因组RNA外，绝大多数RNA分子都来自DNA转录的产物。
转录研究的主要问题
①RNA聚合酶 ②转录过程 ③转录后加工 ④转录的调控
①~③是基本内容，④是目前研究的焦点，转录调控是基因调控的核心。
转录与DNA复制的异同：
相同：要有模板，新链延伸方向5’→3’，碱基的加入严格遵循碱基配对原则。
相异：①复制需要引物，转录不需引物。
②转录时，模板DNA的信息全保留，复制时模板信息是半保留。
③转录时，RNA聚合酶只有5’→3’聚合作用，无5’→3’及3’→5’外切活性。
转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步。
基因表达的终产物：①RNA ②蛋白质
转录过程涉及两个方面
①RNA合成的酶学过程
②RNA合成的起始信号和终止信号，即DNA分子上的特定序列。
DNA正链：与mRNA序列相同的DNA链。
负链：与正链互补的DNA链。
转录单位的起点核苷酸为+1，起点右边为下游（转录区)，转录起点左侧为上游，用负数表示：-1，-2，-3。
第一节 DNA指导的RNA合成（转录)
RNA链的转录，起始于DNA模板的一个特定位点，并在另一位点终止，此转录区域称为一个转录单位。一个转录单位可以是一个基因（真核)，也可以是多个基因（原核)。
基因的转录是有选择性的，细胞不同生长发育阶段和细胞环境条件的改变，将转录不同的基因。
转录的起始由DNA上的启动子区控制，转录的终止由DNA上的终止子控制，转录是通过DNA指导的RNA聚合酶来实现的。
一、 RNA聚合酶
RNA合成的基本特征
①底物：NTP（ATP、GTP、CTP、UTP)
②RNA链生长方向：5’→3’
③不需引物
④需DNA模板
反应：
1、 E.coli RNA聚合酶（原核)
E.coli和其它原核细胞一样，只有一种RNA聚合酶，合成各种RNA（mRNA、tRNA、rRNA)。
一个E.coli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子，在任一时刻，大部分聚合酶（5000左右)正在参与RNA的合成，具体数量依生长条件而定。
E.coli RNA聚合酶全酶|（holoenzyme)分子量46万Da，由六个亚基组成，α2ββ’ σω，另有两个Zn2+。
无σ亚基的酶叫核心酶，核心酶只能使已开始合成的RNA链延长，而不具备起始合成活性，加入σ亚基后，全酶才具有起始合成RNA的能力，因此，σ亚基称为起始因子。
E.coli RNA聚合酶各亚基的大小与功能：
亚基 亚基数 分子量（KD) 基因 功能 www.lindalemus.com
β’ 1 160 rpoC 与模板DNA结合
β 1 150 rpoB 与核苷酸结合，起始和催化部位。
σ 1 70 rpoD 起始识别因子
α 2 37 rpoA 与DNA上启动子结合
ω 1 9 ---- 不详
不同的细菌，β’、β、α亚基分子量变化不大，σ亚基分子量变化较大，44KD~92KD。
σ亚基的功能：核心酶在DNA上滑动，σ亚基能增加酶与DNA启动子的结合常数，增加停留时间，使聚合酶迅速找到启动子并与之结合，σ亚基本身无催化活性。
不同的σ因子识别不同的启动子，从而表达不同的基因。
不同的原核生物，都具有相同的核心酶，但σ亚基有所差别，这决定了原核基因表达的选择性。
RNA聚合酶的催化活性：RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板，转录时DNA的双链结构部分解开，转录后DNA仍然保持双链的结构。
