第四章 酶
酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的高分子生物催化剂。
1957巴斯德提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果。
1 分子Glc→2分子乙醇+2分子CO2  从Glc开始，经过12种酶催化，12步反应，生成乙醇。
1897  Buchner兄弟证明发酵与细胞的活动无关，不含细胞的酵母汁也能进行乙醇发酵。
1913  Michaelis和Menten提出米氏学说—酶促动力学原理。
1926  Sumner首次从刀豆中提出脲酶结晶，并证明具有蛋白质性质。
1969  化学合成核糖核酸酶。
1967-1970  从E.coli中发现第I、第II类限制性核酸内切酶。
1986  Cech发现四膜虫细胞大核期间26S rRNA前体具有自我剪接功能。
ribozyme ，   deoxyribozyme
          E.coRI
                   5’——GAATTC——3’
                   3’——CTTAAG——5’
             限制作用                        修饰作用
        5’——GAATTC——3’           5’——GAATTC——3’
        3’——CTTAAG——5’           3’——CTTAAG——5’
第一节 酶学概论
一、 酶的生物学意义
大肠杆菌生命周期20分钟，生物体内化学反应变得容易和迅速进行的根本原因是体内普通存在生物催化剂—酶。没有酶，生长、发育、运动等等生命活动就无法继续。
限制性核酸内切酶（限制-修饰）
二、 酶的概念及其作用特点
1、 酶是一种生物催化剂
酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的高分子生物催化剂。
生物催化剂 ：酶(enzyme)，核（糖）酶(ribozyme)，脱氧核（糖）酶(deoxyribozyme)
2、 酶催化反应的特点
（1）、 催化效率高
酶催化反应速度是相应的无催化反应的108-1020倍，并且至少高出非酶催化反应速度几个数量级。
（2）、 专一性高
酶对反应的底物和产物都有极高的专一性，几乎没有副反应发生。
（3）、 反应条件温和
温度低于100℃，正常大气压，中性pH环境。
（4）、 活性可调节
根据据生物体的需要，许多酶的活性可受多种调节机制的灵活调节，包括：别构调节、酶的共价修饰、酶的合成、活化与降解等。
（5）、 酶的催化活性离不开辅酶、辅基、金属离子
3、 酶与非生物催化剂相比的几点共性：
①催化效率高，用量少（细胞中含量低）。
②不改变化学反应平衡点。
③降低反应活化能。

P234 图4-1  非催化过程及催化过程自由能的变化

④反应前后自身结构不变。
催化剂改变了化学反应的途径，使反应通过一条活化能比原途径低的途径进行，催化剂的效应只反映在动力学上（反应速度），不影响反应的热力学（化学平衡）。
三、 酶的化学本质
（一） 酶的蛋白质本质
经典概念：所有的酶都是蛋白质，酶是具有催化功能的蛋白质，因此酶具有蛋白质的一切共性。
1、 酶的蛋白质组成
有些酶仅由蛋白质组成，例如，脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等
有些酶不仅含有蛋白质（酶蛋白），还含有非蛋白质成分（辅助因子），只有酶蛋白与辅助因子结合形成复合物（全酶）才表现出酶活性，如超氧化物歧化酶Cu2+、Zn2+）、乳酸脱氢酶（NAD+）
酶的专一性由酶蛋白的结构决定，辅助因子传递电子或某些化学基团。
2、 酶的辅助因子
酶的辅助因子主要有金属离子（Fe2+、Fe3+ 、Cu+、Cu2+、 Mn2+、、Mn3+、Zn2+、Mg2+ 、K+、 Na+ 、Mo6+ 、Co2+等）和有机化合物。
辅酶：与酶蛋白结合较松，可透析除去。
辅基：与酶蛋白结合较紧。

       酶                     辅助因子
CuZn-SOD           Cu2+  Zn2+
Mn-SOD                Mn2+
过氧化物酶              Fe2+或Fe3+
II型限制性核酸内切酶    Mg2+
羧肽酶                  Zn2+

P235  表4-1 一些酶的辅助因子（金属离子）
P237  表4-2  基团反应中的辅酶和辅基。

酶蛋白决定酶专一性，辅助因子决定酶促反应的类型和反应的性质。比如，NAD+可与多种酶蛋白结合，构成专一性强的乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶。
生物体内酶种类很多，而辅助因子种类却很少，原因是一种辅助因子可与多种酶蛋白结合。
（二） ribozyme核酶（具有催化功能的RNA）
1980以前，已知所有的生物催化剂，其化学本质都是蛋白质。
80年代初，美国科罗拉多大学博尔德分校的Thomas Cech和美国耶鲁大学Sidney Altman各自独立发现RNA具有生物催化功能，此发现被认为是近十年生化领域最令人鼓舞的发现，此二人分亨1989诺贝尔化学奖。
ribozyme种类：①自我剪接ribozyme   ②自我剪切ribozyme    ③催化分子间反应ribozyme

后边细讲
四、 按酶蛋白的亚基组成及结构特点分类
1、 单体酶
由一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子
牛胰RNase      124a.a    单链
鸡卵清溶菌酶    129a.a    单链
胰凝乳蛋白酶    三条肽链
单体酶种类较少，一般多催化水解反应。
2、 寡聚酶
由两个或两个以上亚基组成的酶，亚基可以相同或不同，一般是偶数，亚基间以非共价键结合。
①含相同亚基的寡聚酶
苹果脱胱氢酶（鼠肝），2个相同的亚基
②含不同亚基的寡聚酶
琥珀酸脱氢酶（牛心），αβ2个亚基
寡聚酶中亚基的聚合，有的与酶的专一性有关，有的与酶活性中心形成有关，有的与酶的调节性能有关。
大多数寡聚酶是胞内酶，而胞外酶一般是单体酶。

3、 多酶复合体
由两个或两个以上的酶，靠非共价键结合而成，其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。如脂肪酸合成酶复合体。
例如：大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成
①丙酮酸脱氢酶（E1）          以二聚体存在2×9600
②二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2）  70000
③二氢硫辛酸脱氢酶（E3）      以二聚体存在2×56000

复合体：12个E1二聚体  24×96000
             24个E2单体    24×70000
             6个E3二聚体   12×56000  
总分子量560万
4、 多酶融合体
一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，这往往是基因融合的产物。
例如：天冬氨酸激酶I---高丝氨酸脱氢酶I融合体（双头酶）
该酶是四聚体α4，每条肽链含两个活性区域：N-端区域是Asp激酶，C端区域是高Ser脱氢酶。
五、 酶在细胞中的分布
一个细胞内含有上千种酶，互相有关的酶往往组成一个酶体系，分布于特定的细胞组分中，因此某些调节因子可以比较特异地影响某细胞组分中的酶活性，而不使其它组分中的酶受影响。
1. 分布于细胞核的酶
核被膜                  酸性磷酸酶
染色质                  三磷酸核苷酶
核仁                    核糖核酸酶
核内可溶性部分          酵解酶系、乳酸脱氢酶
2. 分布于细胞质的酶
参与糖代谢的酶         酵解酶系
                       磷酸戊糖途径酶系
参与脂代谢的酶         脂肪酸合成酶复合体
参与a.a蛋白质的酶      Asp氨基转移酶
参与核酸合成的酶       核苷激酶  核苷酸激酶
3. 分布于内质网的酶
       光滑内质网       胆固醇合成酶系
      粗糙内质网      蛋白质合成酶系
    （细胞质一侧）
4. 分布于线粒体的酶
外膜：酰基辅酶A合成酶
内膜：NADH脱氢酶
基质：三羧酸循环酶系
      脂肪酸β-氧化酶系
5. 分布于溶酶体的酶
水解蛋白质的酶
水解糖苷类的酶
水解核酸的酶
水解脂类的酶
6. 标志酶
有些酶只分布于细胞内某种特定的组分中，
核：    尼克酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶，功能：DNA、RNA生物合成
线粒体：琥珀酸脱氢酶（电子转移、三羧酸循环）
溶酶体：酸性磷酸酶（细胞成分的水解）
微粒体：（核蛋白体、多核蛋白体、内质网）Glc-6-磷酸酶
上清液：乳酸脱氢酶
第二节 酶的国际分类及命名
一、 习惯命名
1961年6以前使用的酶沿用习惯命名
1.（绝大多数酶）依据底物来命名
如：催化蛋白质水解的酶称蛋白酶。催化淀粉水解的酶称淀粉酶。
2. 依据催化反应的性质命名
如：水解酶、转氨酶
3 结合上述两个原则命名，琥珀酸脱氢酶。
4. 有时加上酶的来源
如：胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶
习惯命名较简单，但缺乏系统性。
二、 国际系统命名
系统名称应明确标明酶的底物及催化反应的性质。
如：草酸氧化酶（习惯名），系统名称：    草酸：氧氧化酶
又如：谷丙转氨酶（习惯名），系统名：    丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶
反应：丙氨酸+α--酮戊二酸→Glu+丙酮酸
三、 国际系统分类法及编号（EC编号）
原则：将所有酶促反应按性质分为六类，分别用1、2、3、4、5、6表示。
再根据底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类分为若干个亚类，编号用1、2、3……，每个亚类又可分为若干个亚一亚类，用编号1、2、3……表示。
每一个酶的编号由4个数字组成，中间以“·”隔开。第一个数字表示大类，第二个数字表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个数字表示在亚-亚中的编号。
1、 氧化还原酶类
催化氧化还原反应：   A·2H+B=A+B·2H

乳酸：NAD+氧化还原酶（EC1.1.1.27），    习惯名：乳酸脱氢酶
         图

2、 转移酶类
AB+C=A+BC
Ala：酮戊二酸氨基移换酶（EC2.6.1.2），    习惯名： 谷丙转氨酶
         图
3、 水解酶类
催化水解反应，包括淀粉酶、核酸酶、蛋白酶、脂酶。
亮氨酸氨基肽水解酶（EC3.4.1.1），    习惯名：  Ile氨肽酶。
4、 裂合酶类（裂解酶）
催化从底物上移去一个基团而形成双键的反应或其逆反应
二磷酸酮糖裂合酶（EC4.1.2.7），     习惯名：醛缩酶
5、 异构酶（EC5.3.1.9）
催化同分异构体相互转化，6-磷酸Glc异构酶
6、 合成酶（连接酶）
催化一切必须与ATP分解相偶联、并由两种物质合成一种物质的反应。

P241 表4-8 酶的国际分类——大类和亚类

举例：乙醇脱氢酶的分类编号是 EC1.1.1.1 ，乳酸脱氢酶EC1.1.1.27 ， 苹果酸脱氢酶EC1.1.1.37

第一个数字表示大类：    氧化还原
第二个数字表示反应基团：醇基
第三个数字表示电子受体：NAD+或NADP+
第四个数字表示此酶底物：乙醇，乳酸，苹果酸。
前面三个编号表明这个酶的特性：反应性质、底物性质（键的类型）及电子或基团的受体，第四个编号用于区分不同的底物。

酶的物种和组织的差异
来自不同物种或同一物种不同组织或不同细胞器的同一种酶，虽然它们催化同一个生化反应，但它们的一级结构可能不相同，有时反应机制也可能不同，可是无论是酶的系统命名法还是习惯命名法，对这些均不加以区别，而定为相同的名称，这是因为命名酶的根据是酶所催化的反应。
例如，  SOD不管来源如何，均催化如下反应
2O2-+2H+→H2O2+O2    H2O2再由过氧化氢酶催化、分解
它们有同一个名称和酶的编号EC1.15.1.1
实际此酶可分三类：
CuZn-SOD   真核生物细胞质中
Mn-SOD     真核生物线粒体中
Fe-SOD
即使同是CuZn-SOD，来自牛红细胞与猪红细胞的，其一级结构也有很大不同。
因此，在讨论一个具体的酶时，应对它的来源与名称一并加以说明。
第三节 酶促反应动力学
酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素，包括低物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂、等。
一、 酶的量度
酶的含量不能直接用重量和摩尔数表示（不纯、失活、分子量不知），而采用酶的活力单位表示
1、 酶活力与酶促反应速度
酶活力：用在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度表示。反应速度快，活力就越高。
酶量—酶活力一反应速度
酶促反应速度的表示方法：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。
单位：浓度/单位时间

      P243  图4-4  酶反应速度曲线

研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准。因为底物浓度降低、酶部分失活产物抑制和逆反应等因素，会使反应速度随反应时间的延长而下降。
2、 酶的活力单位（U）
国际酶学会标准单位：在特定条件下，1分钟内能转化1umol底物的酶量，称一个国际单位（IU）。特定条件：25℃ pH及底物浓度采用最适条件（有时底物分子量不确定时，可用转化底物中1umol的有关基团的酶量表示）。
实际工作中，每一种酶的测活方法不同，对酶单位分别有一个明确的定义。
如 ：限制性核酸内切酶
用粘度法测活性：定义为30℃， 1分钟，使底物DNA溶液的比粘度下降25%的酶量为1个酶单位。
转化率法：标准条件，5分钟使1ug供体DNA残留37%的转化活性所需的酶量为1个酶单位。
凝胶电泳法测活：37℃，1小时，使1ugλDNA完全水解的酶量为1个酶单位。
可见，同一种酶采用不同的测活方法，得到的酶活单位是不同的，即使是同一种测活法，实验条件稍有相同，测得的酶单位亦有差异。
如 淀粉酶，两种定义
A：1 g可溶性starch，在1h内液化所需的enzyme量。
B：l ml 2%可溶性starch ，在1h内液化所需的enzyme量。
1g 酶制剂溶于1000ml H2O，取0.5ml与2%的starch 20ml反应，pH6.0，10分钟完全液化，求酶活力。
A：60/10×20×2%×1/0.5×1000=4800u/克enzyme制剂
B：60/10×20/0.5×1000=240000u/克enzyme制剂
3、 酶的比活力  Specific  activity
每毫克酶蛋白所具有的酶活力。酶的比活力是分析酶的纯度是重要指标。
单位：U/mg蛋白质。
有时用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位表示。

举例：一个酶的分离纯化分为4 步。
步骤             1       2       3       4
总活力（U）      6       4       3       2
总蛋白质（mg）  20      10       5       2
比活力（U/mg）  6/20    4/10     3/5      2/2

酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。

酶的纯化倍数：

酶的回收率：                    ×100%
4、 酶的转换数和催化周期
分子活性定义：每mol的 enzyme  在1秒内转化substrate的 mol数。
亚基或催化中心活性定义：每mol 的active subunit或 active center 在一秒内转化的substrate 的mol 数，称为转换数Kcat
P244图表4—4

转换数的倒数即为催化周期：一个酶分子每催化一个底物分子所需的时间。
如：乳糖脱氢酶转换数为1000/秒，则它的催化周期为10-3秒。

二、 底物浓度对酶促反应速度的影响
单底物酶促反应，包括异构酶、水解酶及大部分裂合催化的反应。
1913 Michaelis 和Menten 提出米—曼方程。
（一） 底物浓度对酶促反应速度的影响——米式学说的提出
1903  Henri    研究蔗糖水解反应。
                         
         sucrose +H2O        acid       glucose +fructose
                          sucrase

酸水解
        V                      V         
                                      
  
   [sucrose] 
                                           
    酶水解          
                                          V
        V                                

     [enzyme]( substrate不变)                     [sucrose] 
底物浓度与酶促反应速度的关系：

当底物浓度不断增大时，反应速度不再上升，趋向一个极限，酶被底物饱和（底物饱和现象）。
中间产物假说：酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物进一步分解成产物和游离的酶。
证据：（1）竞争性抑制实验（2）底物保护酶不变性（3）结晶ES复合物的获得。
米式学说：
1913年，Michaelis和Menten继承和发展了中间产物学说，在前人工作基础上提出酶促动力学的基本原理，并以数学公式表明了底物浓度与酶促反应速度的定量关系，称米式学说：

（二） 米式方程的导出：
1、 基于快速平衡假说——早年的米式方程
最初，Michaelis和Menten是根据“快速平衡假说”推出米式方程。
快速平衡假说：

① 在反应的初始阶段，底物浓度远远大于酶浓度，因此，底物浓度{S}可以认为不变。
② 游离的酶与底物形成ES的速度极快，E + S       ES，而ES形成产物的速度极慢，ES分解成产物P对于[ES]浓度的动态平衡没有影响，不予考虑。
K1、K2》K3
③ 因为研究的是初速度，P的量很小，由P        ES可以忽略不记。

ES的生成速度：K1（[E] - [ES]）[S]
ES的分解速度：K2[ES]
K1（[E] - [ES]）[S]  =  K2[ES]

反应速度：

KS现在称为底物常数
2、 Briggs和Haldane的“稳态平衡假说”及其对米式方程的发展：
稳态平衡假说：

[ES]的的生成与分解处于动态平衡（稳态），有时必须考虑[ES]分解成产物P对于[ES]动态平衡的影响（[ES]分解速度）。或者说，[ES]的动态平衡（分解速度）不仅与ES        E+S有关，还与ES         P + E有关。
稳态平衡假说的贡献在于第②点。

用稳态假说推导米式方程：
ES生成速度：
k1（[E] - [ES]）[S]
ES分解速度：
k2[ES]+k3[ES]
以上两个速度相等。
k1（[E] - [ES]）[S] = k2[ES]+k3[ES]

反应速度：

Vmax=k3 [E]
Km称米氏常数，当Km及Vmax已知时，即可确定酶反应速度与底物浓度的关系。
（三） 米式方程讨论
1、 快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别

当K1、K2＞＞K3时，即ES       P是整个反应平衡中极慢的一步，那么

这就是早年提出的米式方程
因此说，稳态平衡 = 快速平衡 + 慢速平衡，

当ES         P（即K3/K1）极慢时，稳态平衡基本等于快速平衡
2、 Km的物理意义
当反应速度v=1/2 Vmax时， Km = [S]，
Km的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度的一半时底物的浓度。
单位：与底物浓度的单位一致，mol·L-1或mmol·L-1
Km是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。不同的酶Km值不同。

  P248  表4-5  一些酶的Km值。
3、 Km与天然底物
如果一个酶有几种底物，则每一种底物各有一个特定的Km，其中Km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。因为Km愈小（达到Vmax一半所需的底物浓度愈小）表示V变化越灵敏底物。

4、 Km、Ks与底物亲和力
Km称米式常数，Km=（K2+K3）／K1 ，从某种意义上讲，Km是ES分解速度（K2+K3）与形成速度（K1）的比值，它包含ES解离趋势（K2／K1）和产物形成趋势（K3／K1）。
Ks称为底物常数，Ks=K2／K1，它是ES的解离常数，只反映ES解离趋势，因此，1/Ks可以表示酶与底物的亲和力大小（ES形成趋势），不难看出，底物亲和力大不一定反应速度大（产物形成趋势，K3／K1）
只有当K2、K1＞＞K3时，Km≈Ks，因此，1/Km只能近似地表示底物亲和力的大小。
问题：
（1） Km越小，底物亲和力越大（X）
（2） Ks越小，底物亲和力越大（√）
（3） 天然底物就是亲和力最大的底物（X）
（4） 天然底物就是Km值最小的底物（√）

5、 Km与米式方程的实际用途
已知V求[S]
已知[S]求V
相对速度（酶活性中心被占据分数Y）：

当v=Vmax时，表明酶的活性部位已全部被底物占据，v与[S]无关，只和[Et]成正比。当v=1/2 Vmax时，表示活性部位有一半被占据。
设定达到最大反应速度的0.9倍时，所需底物浓度为[S]0.9
[S]0.9=9Km
同理有：[S]0.8=4Km
              [S]0.7=2.33Km
              [S]0.6=1.5Km
              [S]0.5=1Km
              [S]0.1=1/9Km
[S]0.9 /[S]0.1=81
[S]0.7/[S]0.1=21

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