（四） Km和Vmax的求解方法
1、 双倒数作图法
要从实验数据所得到的v-[S]曲线来直接决定Vmax是很困难的，也不易求出Km值。
由米式方程两边取倒数：

将实验所得的初速度数据v和[S]取倒数，得各种1/v和1/[S]值，将1/v对1/[S]作图，得
P250 图4-6

上图[S]范围在0.330—2.0Km，最适。
若[S]范围在3.3—20 Km ，直线斜率太小。
若[S]范围在0.033––0.2 Km ，直线斜率太大。
如当Km=1×10-5mol/L时，实验所取底物浓度范围应在0.33×10-5－2.0×10-5mol/L。
一般选底物浓度应考虑能否得到1/[S]的常数增量。
如当选[S]为1.01、1.11、1.25、1.42、1.66、2.0、2.5、3.33、5.0、10时
1/[S]为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0是常数增量。
反之，若选[S]为常数增量1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10时，
1/[S]为0.1、0.111、0.125、0.5、1.0，是非常数增量，点多集中在1/v轴附近。
2、 V—V/[S]作图法
P250  图4-7
三、 多底物的酶促反应
前面讨论的米氏方程（推导米氏方程时用的是单底物），适用于单底物酶促反应，如异构、水解及大部分裂合反应，不适用于多底物反应。
A、B、C表示底物，按照底物与酶的结合顺序，产物则按它们从酶产复合物中释放次序分别用P、Q、R表示。
双底物酶促反应已知有三种机理
1、 有序顺序反应机理
底物A、B与酶结合的顺序是一定的，产物P、Q的释放顺序也是一定的。
       P251

举例：P251 乙醇脱氢酶
2、 随机顺序反应机理
底物A、B与酶结合的顺序是随机的，产物P、Q的释放顺序也是随机的。

P252
如糖原磷酸化酶
3、 乒乓反应机理
先结合第一个底物A，释放第一个产物P，酶的构象发生变化，结合第二个底物B，释放第二个产物Q。
       P252

举例：  谷丙转氨酶
四、 pH对酶促反应速度的影响
1. pH影响酶活力的因素
①影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。医学全在线www.lindalemus.com
②影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的解离状态，最终影响ES形成。
③影响酶和底物分子中另一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。
2．酶的最适pH和稳定性pH
最适pH：使酶促反应速度达到最大时的介质pH。
酶在试管反应中的最适pH与它所在细胞中的生理pH不一定完全相同，为什么？
几种酶的最适pH，见P253表4—6。

稳定性pH：在一定pH范围内，酶不会变性失活，此范围称酶的稳定性pH。
         图

A．最适pH曲线：最适pH=6.8
B．稳定性pH曲线：pH5~8
曲线B：将酶在不同pH下保温，再调回pH6.8，测定反应速度。
曲线B说明，在pH6.8~8及5~6.8范围内反应速度的降低，不是由于酶蛋白变性失活造成的，而是由于酶或底物形成了不正常的解离，而在pH ＞8和pH＜5范围，则是由两种因素共同作用的结果。
虽然大部分酶的pH—酶活曲线是钟形，但也有半钟形甚至直线形。
P254 图4-9 酶的pH—酶活曲线
五、 温度对酶促反应速度的影响。
1．最适温度及影响因素 
温度对酶促反应速度的影响有两个方面：
①提高温度，加快反应速度。
②提高温度，酶变性失活。
这两种因素共同作用，在小于最适温度时，前一种因素为主；在大于最适温度时，后一种因素为主。最适温度就是这两种因素综合作用的结果。
温度系数Q10：温度升高10℃，反应速度与原来的反应速度之比，Q10一般为1~2。
温血动物的酶，最适温度35℃—40℃，植物酶最适温度40℃—50℃，细菌Taq DNA聚合酶70℃。
2．酶的稳定性温度
在某一时间范围内，酶活性不降低的最高温度称该酶的稳定性温度。
酶的稳定性温度有一定的时间限制。
稳定性温度范围的确定方法：将酶分别在不同温度下预保温一定时间，然后回到较低温度（即酶的热变性失活作用可忽略的温度），测酶活性。
         图
酶浓度高、不纯、有底物、抑制剂和保护剂会使稳定性温度增高。
酶的保存：
①液体酶制剂可以利用上述5种因素中的几种，低温（几个月）。
②干粉，可在室温下放置一段时间，长期保存，应在低温冰箱中。
六、 酶浓度对酶促反应速度的影响
如果底物浓度足够大，使酶饱和，则反应速度与酶浓度成正比。

Vmax  =  K3 [E]

[S]过量且不变时，v∝[E]。
七、 激活剂对酶促反应速度的影响
凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。activator
激活剂作用包括两种情况：
一种是由于激活剂的存在，使一些本来有活性的酶活性进一步提高，这一类激活剂主要是离子或简单有机化合物。
另一种是激活酶原，无活性→有活性，这一类激活剂可能是离子或蛋白质。
1、 无机离子的激活作用
（1）金属离子：K+ 、Na+、Mg2+ 、Zn2+、Fe 2+ 、Ca2+
（2）阴离子：cl-、Br -
（3）氢离子
许多金属离子是酶的辅助因子，是酶的组成成分，参与催化反应中的电子传递。
有些金属离子可与酶分子肽链上侧链基团结合，稳定酶分子的活性构象。
有的金属离子通过生成螯合物，在酶与底物结合中起桥梁作用。
注意：
（1） 无机离子的激活作用具有选择性，不同的离子激活不同的酶。
（2） 不同离子之间有拮抗作用，如Na+与K+、Mg+与Ca+，但Mg+与Zn+常可替代。
（3） 激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，1~50mM
2、 简单有机分子的激活作用
①还原剂（如Cys、还原型谷胱甘肽）能激活某些活性中心含有—SH的酶。
②金属螯合剂（EDTA）能去除酶中重金属离子，解除抑制作用。

抑制剂对酶促反应速度的影响
酶是protein ，凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用称为酶的失活作用。
抑制作用：使酶活力下降但并不引起酶蛋白变性的作用称为抑制作用。（不可逆抑制、可逆抑制）
抑制剂（inhibitor）：不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上某些必需基团（活性中心上一些基团）发生变化，引起酶活性下降，甚至丧失，此类物质称为酶的抑制剂。
研究抑制剂对酶的作用有重大的意义：
（1） 药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发：抗癌药
（2） 对生物体的代谢途径进行认为调控，代谢控制发酵
（3） 研究酶的活性中心的构象及其化学功能基团，不仅可以设计农药，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础
（一） 不可逆抑制作用（非专性必、专一性）
抑制剂与酶活性中心基团共价结合，使酶的活性下降，无法用透析法除去抑制剂。
1、 非专一性不可逆抑制剂
此类抑制剂可以和一类或几类基团反应。它们不但能和酶分子中的必需基团作用，同时也能和相应的非必需基团作用。
（1）、 酰化剂
二异丙基磷酰氟酯（DFP，神经毒气）和许多有机磷农药都属于磷酰化剂，能与酶活性中心Ser的—OH结合，抑制某些蛋白酶及酯酶。这类化合物的作用机理是强烈地抑制与中枢神经系统有关的乙酰胆碱脂酶，使乙酰胆碱不能分解为乙酰和胆碱。乙酰胆碱的堆积，引起一系列神经中毒症状。

Ｐ258 结构式：磷酰化剂与DFP
P259  反应式：磷酰化剂与胆碱酯酶形成磷酰化胆碱酯酶

解毒剂：PAM（解磷定），可以把酶上的磷酸根除去。
（2）、 烷化剂
许多有机汞、有机砷都是烷化剂，可以使酶的巯基烷化

P259 反应式：对氯汞苯甲酸与巯基酶的反应

有机汞、有机砷化合物和重金属还可以与还原型硫辛酸（人体重要的辅酶）反应
解毒剂：二巯基丙醇
（3）、 氰化物
与含铁扑啉的酶中的Fe2+结合，阻抑细胞呼吸。
（4）、 重金属
Ag、Cu、Hg、Cd、Pb能使大多数酶失活，EDTA可解除。
（5）、 还原剂
以二硫键为必需基团的酶，可以被巯基乙醇、二硫苏糖醇等巯基试剂还原失活。
（6）、 含活泼双键试剂（与—ＳＨ、—ＮＨ２反应）
Ｎ—乙基顺丁烯二酰亚胺
         图
（7）、 亲电试剂
四硝基甲烷，可使Tyr硝基化。
         图
2、 专一性不可逆抑制
此类抑制剂仅仅和活性部位的有关基团反应。
（1）、 Ks型专一性不可逆抑制剂
Ks型抑制剂不仅具有与底物相似的、可与酶结合的基团，同时还有一个能与酶的其它基团反应的活泼基团。
专一性：抑制剂与酶活性部位某基团形成的非共价络合物和抑制剂与非活性部位同类基团形成的非共价络合物之间的解离常数不同。
举例：
胰凝乳蛋白酶的Ks型不可逆抑制剂：对一甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲烷（TPCK）与该酶的最佳底物对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯的结构相似，都含有对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酰基，酶通过对这个基团的强亲和力，把TPCK误认为底物而与之结合，形成Ks很小的非共价络合物。
《酶学》P119

          最佳底物                                TPCK
-CH2-cl与酶活性部位的一个His-咪唑基距离很近，很易使之烷基化，而非活性部位的咪唑基，由于远离-CH2-cl，则不被烷基化。
（2）、  Kcat型专一性不可逆抑制剂
这种抑制剂是根据酶的催化过程来设计的，它们与底物类似，既能与酶结合，也能被催化发生反应，在其分子中具有潜伏反应基团（latent  reactive  group），该基团会被酶催化而活化，并立即与酶活性中心某基团进行不可逆结合，使酶受抑制。此种抑制专一性强，又是经酶催化后引起，被称为自杀性底物。
举例1：
β-羟基癸酰硫酯脱水酶的Kcat型不可逆抑制剂：CH3(CH2)5-C=C-CH2-CO-S-R
此酶催化的反应：
         P260反应式

当有Kcat抑制剂时，此抑制剂被催化生成连丙二烯结构，连丙二烯易与His咪唑反应，使酶失活。
        P261反应式

举例2：
以FMN（黄素单核苷酸）、FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）为辅基的单胺氧化酶的Kcat型不可逆抑制剂；炔类化合物。
迫降灵是一种单胺氧化酶的自杀性底物，是治疗高血压的良药。
        图

单胺氧化酶能氧化某些血管舒张剂（如组胺）
         图

由于迫降灵能抑制单胺氧化酶，也就能抑制一些血管舒张剂（如组胺）的氧化，因而有降血压的作用。
Kcat型专一性不可逆抑制剂的专一性很强，近来已设计出多种酶的Kcat逆制剂，在医疗方面起到很大作用。
（二） 可逆抑制作用 Reversible  Inhibition
此类抑制剂与酶蛋白的结合是可逆的，可以用透折法除去抑制剂，恢复酶的活性。
1、 竞争性抑制（Competitive inhibition）
抑制剂与底物竞争酶的活性中心。
竞争性抑制剂具有与底物类似的结构，可与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合。可以通过增加底物浓度而解除此种抑制。

P258  图4-11 酶与底物及竞争性、非竞争性抑制剂结合的模型

举例1：丙二酸抑制琥珀酸脱氢酶

举例2：磺胺类药物及其作用机理
磺胺类药物可以抑制细菌的生长繁殖，治疗细菌引起的各种疾病。
磺胺类药物是对氨基苯磺酰胺或其衍生物，它是对氨基苯甲酸的结构类似物，竞争性抑制二氢叶酸合成酶

P261 结构式：对氨基苯甲酸   对氨基苯磺酰胺   叶酸

磺胺类药物的药理（对氨基苯磺酰胺）：
嘌呤核苷酸的合成必需要由四氢叶酸（辅酶）提供一碳单位；四氢叶酸可由二氢叶酸或叶酸转化而成；二氢叶酸是在二氢叶酸合成酶作用下，利用蝶呤、对氨基苯甲酸及Glu合成。
动物体内的叶酸可从食物中获取，细菌体内的叶酸只能在二氢叶酸合成酶作用下，利用对氨基苯甲酸合成。
如果动物体内含有大量的对氨基苯磺酰胺，可与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶的活性中心，抑制细菌二氢叶酸合成。
2、 非竞争性抑制
特点：抑制剂与酶活性中的以外的基团结合，其结构可能与底物无关。
酶可以同时与底物及抑制剂结合，但是，中间产物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低。显然，不能通过增加底物的浓度的办法来消除非竞争性抑制作用。
非竞争性抑制剂多是与酶活性中心之外的巯基可逆结合，包括某些含金属离子的化合物（Cu2+、Hg2+、Ag+）和EDTA，。
3、 反竞争性抑制
酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。E+S→ES+I ≠ P
（三） 可逆抑制作用的动力学

用书上P263-266的方法可推出三种抑制方程。
1、 竞争性抑制：
动力学方程：

竞争性抑制曲线:

P263  图4-12竞争性抑制曲线

竞争性抑制作用小结：
（1） Vmax不变，Km变大。要达到同一个给定的Vmax分数，必须要有比无抑制剂时大得多的底物浓度。
（2） 竞争性抑制剂对酶促反应的抑制程度，决定于[I]、[S]、Km和Ki
A. [I]一定，增加[S]，可减少抑制程度。
B. [S]一定，增加[I]，可增加抑制程度（Km’增加）。
C. Ki值较低时，任何给定[I]和[S]，抑制程度都较大，Ki越大，抑制作用越小。
D. [I]=Ki时，所作双倒数图直线的斜率加倍。
E. 在一定[S]、[I]下，Km值愈低，抑制程度愈小。
2、 非竞争性抑制
动力学方程：

相对速度：

抑制分数：

非竞争抑制曲线：

P265  图4-13

非竞争性抑制剂可使酶促反应的Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki），而对Km无影响。它对酶促反应的抑制程度决定于[I]和Ki ，与酶的Km和[S]无关。
3、 反竞争性抑制
动力学方程：

相对速度：

抑制分数：

P265   图4-14  反竞争抑制曲线

在反竞争性抑制作用下，Km及Vmax都变小，且Km’<KM&NBSP;&NBSP;

P266  表4-7 小结：   三种可逆抑制作用的酶促反应速度V与Km值
九、 有机介质中的酶促反应（只是一部分酶）
传统观点：酶是水溶性生物大分子，只能在水介质中进行催化反应，有机介质会使酶变性。
其实在细胞中，许多生物膜上的酶就是在低极性的微环境中发挥催化功能的。
优点：     ①利于疏水性底物的反应。
            ②可提高酶的热稳定性，提高催化温度。
            ③能催化在水中不能进行的反应。
            ④可改变反应平衡移动方向。
            ⑤可控制底物专一性。
            ⑥防止由水引起的副反应。
            ⑦可扩大pH值的适应性等等。
1、 有机介质中酶促反应的条件
（1）、 必需水（结合水）
酶催化活性所必需的构象，是由水分子直接或间接地通过氢键等非共价相互作用来维持的，因此只有与酶分子紧密结合的单层水分子，对酶的催化活性才是至关重要的。
这紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化活性所必需的最少量的水称为必需水（或结合水、束缚水）。
酶的活性由必需水决定，而与溶剂里的水含量无关，只要必需水不丢失，其它大部分水即使都被有机溶剂取代，酶仍然保持其催化活性。
因此，可把有机介质中酶促反应理解为宏观上是在有机介质中，而在微观上仍是水中的酶促反应。正因如此，才能使用有机介质代替水溶液，进行酶促反应。
一个干燥的酶水合：             吸附水量：
酶分子表面电荷基团：          0-0.07g/g  (水/酶)
酶分子表面极性基团：          0.07-0.25g/g
弱极性、非极性基团：          0.25-0.28g/g
表面完全水化，被一层水分子包围。
酶的必需水含量因酶而异。
脂肪酶：几个水分子/每个酶分子
胰凝乳蛋白酶：50个水分子/每个酶分子
乙醇脱氢酶：几百个水分子/每个酶分子
（2）、 对酶的要求
具有对抗有机介质变性的经能力。
（3）、 合适的溶剂及反应体系
（4）、 合适的pH
保证有机介质中酶的微环境具有最适pH值。酶应从具有最适pH值的缓冲液中冻干或沉淀出来。
2、 有机介质对酶性质的影响
（1）、 稳定性
大多数酶在低水有机介质中比在水介质中更稳定。
a. 热稳定性提高
例如：猪胰脂肪酶在醇和酯中进行催化反应，在100℃半衰期长达12h，其活性比25℃时还高几倍
b. 储存稳定性提高
胰凝乳蛋白酶在20℃时，在水中半衰期只几天。在辛烷中，可放6个月，仍保持全部活性。
（2）、 活性 
有两类影响   升高活性
                   降低活性
酶的超活性：高于水溶液中酶活性值的活性。
（3）、 专一性
某些有机溶剂会使某些酶的专一性发生变化，如脂肪酶在有机介质中有合成肽键的功能。星号活力（第二活力）。
（4）、 反应平衡
有机介质能改变某些酶催化的反应平衡。
例如：水解酶类（蛋白水解酶）
在水介质中，水的浓度为55.5mol/L，平衡趋向水解方向，
如在含水量极低的有机介质中，平衡向含成方向偏移。

实例：（酶）       合成）产物       溶剂      合成收率 
枯草杆菌蛋白酶    核糖核酸酶      甘油90%     50%
无色杆菌蛋白酶     胰岛素         乙醇30%     80%
凝血酶             人生长素       甘油80%     20%
（5）、 分子印迹和pH记忆
酶在冻干前可用配体作印迹。
竞争性抑制剂，可诱导酶活性中心构象发生变化，形成一种高活性构象，而此种构象在除去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得到保持。
pH记忆：
酶在有机介质中能“记住”它最后存在过的水溶液的pH值，因该pH值决定了酶分子上有关基团的解离状态，这种状态在冻干过程和分散到有机介质中之后仍得到保持。
第四节 酶的作用机理
一、 专一性的机理
（一） 酶专一性类型
一般说来，一种分子能成为某种酶的底物，必须具备两个条件：
分子上有被酶作用的化学键。
分子上有一个或多个结合基团能与酶活性中心结合。

2、 诱导楔合模型
酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。

P271     图4—18

二、 高效性的机理
1、 邻近效应与定向效应
酶把底物分子（一种或两种）从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生。
两种效应对反应速度的影响
①使底物浓度在活性中心附近很高
甚至比溶液中高10万倍，提高反应速度。
②酶对底物分子的电子轨道具有导向作用
举例：酚羟基和羧基环化成内酸
         图
3个CH3固定了-OH和-COOH的相对方位。
③酶使分子间反应转变成分子内反应
反应速度提高：107
         图
④邻近效应和定向效应对底物起固定作用
酶底复合物寿命比一般双分子相互碰撞的平均寿命长，前者10-7-10-4秒，后者10-13秒，增大了产物形成的机率。
2、 扭曲变形和构象变化的催化效应
酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力。

P276  图4-20

环状反应物I水解开环，环扭曲能量大量释放，加速反应。
底物与酶蛋白接触，加速反应。
①酶从低活性形式转变为高活性形式
②底物扭曲、变形
③底物构象变化，变得更像过度态结构，大大降低活化能。
3、 共价催化
酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物，此中间物易变成过渡态，反应活化能大大降低，提高反应速度。
①亲核共价催化
丝氨酸羟基、Cys的-SH、His的咪唑基。
举例：咪唑基催化对硝基苯乙酸酯水解。
      图

②亲电共价催化
     亲电基团攻击底物的富电子基团
例：Asp转氨酶催化Asp 转氨反应
         图
P278  表4-13  形成共价ES复合物的某些酶
4、 酸碱催化
酶分子的一些功能基团起质子供体或质子受体的作用。
参与酸碱催化的基团：氨基、羧基、巯基、酚羟基、咪唑基。

P279 表4-14 酶分子中可作为广义酸碱的功能基团

影响酸碱催化反应速度的两个因素
⑴酸碱强度，咪唑基在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。
⑵给出质子或结合质子的速度，咪唑基最快

①酸催化酯、酰胺和肽的水解
        图

过程：共轭酸与＞C=0氧形成氢键，使＞C=0碳带更多正电荷，更易吸引H2O分子上的氧，降低＞C=0碳与H2O氧形成共价键的活化能；接着，共轭酸将H+转移给＞C=0氧，自己成为共轭碱，并从H2O分子吸引一个H+， 回复原状。
②碱催化酯、酰胺水解
      图

过程：共轭碱先与H2O中H形成氢键，使H2O中氧的电负性增强，更易对＞C=0碳进行亲核进攻，降低碳氧键生成的活化能。
5、 活性中心的微环境
⑴ 疏水环境
酶活性中心附近往往是疏水的，介电常数低，可加强极性基团间的反应。
⑵电荷环境
在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子，增加酶促反应速度。如溶菌酶Asp52带负电荷，可以稳定过渡态的正离子。
酶催化反应的高效性，可能是由于以上五种因素中的几种因素协同作用的结果，而非酶催化反应往往只有一种催化机制。
三、 某些酶的活性中心及其作用机理
（一） 酶的活性中心
1、 活性中心的概念
对于不需要辅酶的酶来说，活性中心就是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基的某些基团，它们在一级结构上相距可能很远，通过肽链的盘绕、折叠而在空间构象上相互靠近。
对于需要辅酶的酶来说，辅酶分子或辅酶分子的某一部分结构往往就是活性中心的组成部分。
一般认为，活性中心有两个功能部位：底物结合部位，催化部位
活性中心外的部位为活性中心的形成提供了结构基础 。
2、 活性中心的氨基酸残基
有七种a.a在酶活性中心出现的频率最高，它们是Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。
活性中心的a.a残基往往分散在相互较远的a.a顺序中，有的甚至分散在不同的肽链上，如α-胰凝乳蛋白酶活性中心的几个a.a残基，分别位于B、C两个肽链上，靠分子空间结构的形成，集中在酶分子特定区域，成为具有催化功能的活性中心。
酶分子a.a残基分类
（1）接触残基
它们与底物接触，参与底物的化学转变，此类a.a残基的一个或几个原子与底物分子中一个或几个原子的距离都在一个键距离之内（1.5-2A）。
它们的侧链起与底物结合作用的称为结合基团，起催化作用的称为催化基团。
（2）辅助残基
它不与底物接触，而是在使酶与底物结合及协助接触残基发挥作用方面起作用。
上述两类残基构成酶活性中心。
（3）结构残基
在维持酶分子正常三维构象方面起重要作用，它们与酶活性相关，但不在酶活性中心范围内，属于酶活性中心以外的必需残基
上述三类残基统称酶的必需基团，若被其它a.a取代，往往造成酶失活。
（4）非贡献残基（非必需基团）
它们对酶活性的显示不起作用，可由其它a.a代替，且在酶分子中占很大比例。
它们可能在免疫，酶活性调节，运输转移，防止降解等方面起作用。
                                            结合底物作用（结合残基）
                               接触残基
                     活性中心               催化作用（催化基团）
           必需基团            辅助残基
                     活性中心外（结构残基）
酶蛋白
           非必需基团
3、 活性中心区域的一级结构
由于一些酶的活性中心一级结构结构与催化机理极其相似，可把它们归为一族。
蛋白水解酶就有几个族：
（1）丝氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶、胰乳蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等）
（2）锌蛋白酶（羧肽酶等）
（3）巯基蛋白酶（木瓜蛋白酶等）
（4）羧基蛋白酶（胃蛋白酶等）
在同一族酶中，活性中心一级结构的a.a顺序极相似。
酶                                 a.a顺序
胰蛋白酶（牛）         Asp-Ser-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Ser-Gly-Lys
胰凝乳蛋白酶（牛）     Ser-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Lys- Lys-Asn
弹性蛋白酶（猪）       Ser-Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-His-Cys-Leu-Val-Asn
凝血酶（牛）         …Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro
这4个源于哺乳动物的酶活性中心，都含有一个包括Ser在内的完全相同的六肽：
         …Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro…
u 同源的趋异进化
来自胰脏的胰凝乳蛋白酶（Phe、 Tyr、 Trp、）、胰蛋白酶（Lys、Arg ）和弹性蛋白酶（疏水残基），活性中心Ser附近的a.a顺序相同，且分子一级结构中有40%a.a顺序相同，三维结构也相同，表明它们起源于共同的祖先，但是它们的底物专一性不同。
这种来源于共同祖先，经基因突变而得出不同专一性的结果称为同源的趋异进化。
u 异源的趋同进化
来自枯草杆菌的Ser蛋白酶的结构与上述三种酶很不同，且活性中心Ser附近的a.a顺序也不同（-Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Ser）。
电荷中继网的位置也不同：

电荷中继网的位置也不同：
Asp102-His57-Ser195（胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶）
Asp32-His64-Ser221（枯草杆菌蛋白酶）
这表明枯草杆菌蛋白酶与胰凝乳蛋白酶等三个酶来源不同，但它们的电荷中继网相同，功能相同，这种情况称异源的趋同进化。
4、 判断和研究活性中心的主要方法
（1）通过酶的专一性（2）酶的化学修饰法（3）亲合标记法（4）X射线晶体衍射法
（二） 酶作用机理举例
1、 胰凝乳蛋白酶的作用机理：
（1）、 专一性
         图

该酶需要底物有一个疏水基团结合于酶上的疏水部位，这个结合起定位作用，使底物敏感键对准酶的催化基团。
疏水定位基团：Phe、Tyr、Trp
（2）、 催化机理
① 活性中心：Ser195—His57—Asp102，三者构成一个氢键体系，His57的咪唑基是Ser195的羟基和Asp102的羧基之间的桥梁，这个氢键体系称为电荷中继网（harge  relay  network）。通过电荷中继网，进行酸碱催化及共价催化。Ser195由于His57和Asp102的影响而成为很强的亲核基团，它是活性中心的底物结合部位，His57是活性中心的催化部位。

ＰP285 图4-27，P287 图4-30 胰凝乳蛋白酶中的电荷中继网

② 胰凝乳蛋白酶对多肽的水解过程 

      P288  图4—31胰凝乳蛋白酶对多肽的水解过程

第一阶段  酰化
Ser195--OH 中的氧攻击肽键的羰基碳，形成四联体过渡态（Ser195—OH、底物的酰基、底物的氨基、His的咪唑），敏感肽键断裂，底物中的胺成分通过氢键与酶的His57咪唑基相连，底物的羧基部分酯化到Ser195的羟基上。
第二阶段  脱酰
电荷中继网从水中吸收一个质子，结果产生的OH-攻击连在Ser195上底物的羧基碳原子，形成四联体过渡态，然后His57供出一个质子给Ser195上的氧原子，结果底物中的酸成分从Ser195上释放。

除胰凝乳蛋白酶外，在催化中具有Asp-His-Ser电荷中继网的还有胰蛋白酶，弹性蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶等，但它们的底物结合部位不同，底物专一性也不同。

P288  图4-32三种胰脏中的蛋白酶的底物结合部胰凝乳蛋白酶          胰蛋白酶          弹性蛋白酶
可供芳香环及大     可供带电荷的    只能让Ala等小分子
的非极性侧链伸入    Lys.、Arg进入        进入
第五节 多酶体系与酶活性的调节控制
一、 多酶体系
（一） 多酶体系及其分类
细胞中的许多酶，常常在一个连续的反应链中起作用，前一个反应的产物是后一个反应的底物。
多酶体系：multienzyme system在完整细胞内的某一代谢途径中，由几个酶形成的反应链体系。
可分为三种类型：可溶性的（分散性的），结构化的（多酶复合体），在细胞结构上有定位关系的（结构化程度更高）。
     P297 图4—42（分散性的多酶体系）  图4-43 （多酶复合体）
（二） 多酶体系的自我调节
（1）大部分具有自我调节能力的多酶体系，第一步反应就是限速步骤，它控制着全部反应序列的总速度。
（2）反馈抑制与底物激活
催化第一步反应的酶，大多都是别构酶，能被全部反应序列的最终产物所抑制，有时则是反应序列分叉处的酶受到最终产物的抑制，称为反馈抑制；有的被底物激活

P299   图4-45反馈抑制与底物激活

正调节物：一般是别构酶的底物，可以激活别构酶。
负调节物：可以抑制别构酶，一般是代谢序列的最终产物。
通过多酶体系的自我调节（反馈抑制和底物激活），可使代谢过程得以协调地、有条不紊地合理进行。
下面讨论具体到每个酶是怎样调节的
二、 酶活性的调节控制和调节酶
调节酶：活性可被调节的酶，主要是别构酶和共价调节酶。
（一） 别构效应的调控
别构效应：调节物（效应物）与别构酶分子中的别构中心（调节中心）结合后，诱导产生或稳定住酶分子的某种构象，使酶活性中心对底物的结合催化作用受到影响，从而调节酶促反应的速度。
（1）、 别构酶的结构特点和性质
（1） 已知的别构酶都是寡聚酶，含有两个或两个以上亚基
（2） 具有活性中心和别构中心（调节中心），活性中心负责底物结合和催化，别构中心负责调节酶反应速度。活性中心和别构中心处在不同的亚基上或同一亚基的不同部位上。
（3） 多数别构酶不止一个活性中心，活性中心间有同种效应，底物就是调节物：有的别构酶不止一个别构中心，可以接受不同的代谢物的调节。
（4） 别构酶由于同位效应和别构效应，不遵循米式方程，动力学曲线也不是典型的双曲线型，而是S型（同位效应为正协同效应）和压低的近双曲线（同位效应为负协同效应）。
（2）、 别构酶的动力学曲线
① 同位效应为正协同效应的别构酶是S型曲线
P303  图4-46   4-47

这种S形曲线体现为，当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度地控制反应速度，这是别构酶可以灵活地调节反应速度的原因。
米氏酶：[S]0.9/[S]0.1=81
别构酶：[S]0.9/[S]0.1=3
表明当底物浓度发生较小变化时，如上升3倍，别构酶的酶促反应速度可以从0.1Vmax升至0.9Vmax 。

当增加正调节物浓度时Km减小，亲和力增大，协同性减小：当增加负调节物的浓度时Km增加，亲和力减小，协同性增大（对底物浓度的反应灵敏度增加）。
② 同位效应为负协同效应的别构酶是近似双曲线
P304图4-48
负协同效应时酶的反应速度对底物浓度的变化不敏感
（3）、 别构酶调节活性的机理
① 序变模型：
酶分子中亚基结合底物后，构象逐个地依次变化。
② 齐变模型：
（4）、 别构酶的鉴定
① S型曲线是必要但不充分条件
② 脱敏作用
③ [S]0.9／[S]0.1
Rs=81 米氏酶
Rs＜81 正协同
Rs＞81 负协同
④ Hill系数法
（二） 可逆共价修饰的调控（共价调节酶）
共价调节酶：酶分子被其它的酶催化进行共价修饰，从而在活性形式与非活性形式之间相互转变。
举例：糖原磷酸化酶  
P313  图4-57

信号的级联放大：
1分子磷酸化酶激酶，活化生成几千个磷酶化酶a
1分子磷酸化酶a，催化生成几千个1-P-G
共价调节酶的两种常见类型
①磷酸化         去磷酸化     -OH  ATP
②腺苷酰化        脱腺苷酰化  腺苷酰基由ATP提供
（三） 酶原的激活
具有不可逆性。属于此类的有消化系统中的酶（胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶）和血液凝固系统中的酶。
（1）、 胰凝乳蛋白酶原的激活（由胰蛋白酶激活）

P314    图4-58
（2）、 胰蛋白酶对胰脏蛋白酶原的激活
                 肠激酶
              胰蛋白酶原       胰蛋白酶

胰凝乳蛋白酶原                弹性蛋白酶原
                       胰蛋白酶
胰凝乳蛋白酶                  弹性蛋白酶
                羧肽酶原        羧肽酶
（四） 专一性调控蛋白（调控因子）对酶活性的调节控制
钙调蛋白、激素结合蛋白，促进或抑制特异的酶活性
第六节 酶与抗体——抗体酶 abzyme(antibody enzyme)
参阅 P293
又称催化性抗体（catalytic antibody），是一种具有催化功能的抗体分子。
过渡态理论：酶与底物不是在基态，而是在过渡态结构互补，亲和力最强，释放出的结合能使过渡态结合物能级降低，利于反应物分子越过能垒，加速反应。
而抗体与抗原是基态结合。

第七节 同工酶、诱导酶
1、 同工酶
能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构不同的一组酶，存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织中，甚至同一组织、同一细胞中。
哺乳动物乳酸脱氢酶有5种
CH3CHOH-COO-+NAD+  LDH   CH3COCOO-+NADH+H+
均由4个亚基组成
HHHH     在心肌中占优势
HHHM 
HHMM
HMMM
MMMM   在骨骼肌中占优势
2、 诱导酶
酶可相对地区分为结构酶和诱导酶。
结构酶：指正常细胞内存在的酶，它的含量较稳定，受外界因素影响很小。
诱导酶：在正常细胞中含量极少或没有，当细胞中加入特定诱导物后，诱导产生的酶，含量在诱导物存在下显著增高，诱导物往往是该酶的底物或底物类似物。
如：大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶
E.coli在含Glc的培养基中
E.coli在只含乳糖的培养基中：Glc-β(1→4)Gal苷
第八节 酶工程

计划：8学时

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