P345 图5-12 tRNA的二级结构(三叶草模型)
1966年Crick对于tRNA能识别几种密码子的现象,提出碱基配对的“摆动学说”: 认为除A-U、G-C配对外,还有非标准配对,I-A、I-C、I-U,并强调密码子的5’端第1、2个碱基严格遵循标准配对,而第3个碱基可以非标准配对,具有一定程度的摆动灵活性。 四、 mRNA的结构 mRNA是从DNA上转录而来的,其功能是依据DNA的遗传信息,指导各种蛋白质的生物合成,每一种蛋白质都由一种相应的mRNA编码,细胞内 mRNA种类很多,大小不一,每种含量极低。 从功能上讲,一个基因就是一个顺反子,原核生物的mRNA是多顺反子,真核mRNA是单顺反子。 顺反子:是由顺反试验所规定的遗传单位,相当于一种蛋白质的基因。 1、 真核mRNA (1)、 3’-端有一段约30-300核苷酸的polyA。 PolyA是转录后,经polyA聚合酶添加上,polyA聚合酶对mRNA专一。 原核mRNA一般无polyA。polyA与mRNA半寿期有关,新合成的mRNA,其polyA较长;而衰老的mRNA,其polyA较短。 polyA功能: PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。 PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。 (2)、 5’-帽子帽子 5’末端的鸟嘌呤N7被甲基化,鸟嘌呤核苷酸经焦磷酸与相邻的一个核苷酸相连,形成5’-5’-磷酸二酯键。 P346 帽子结构
帽子的功能: 可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA。 可为核糖体提供识别位点,使mRNA很快与核糖体结合,促进蛋白质合成起始复合物的形成。 2、 原核mRNA(多顺反子) 原核mRNA由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。没有5/帽子和3/polyA。 举列:MS2病毒mRNA,3569 b,有三个顺反子,分别编码A蛋白、外壳蛋白和复制酶三种蛋白质。
图MS2病mRNA
5’端先导区中,有一段富含嘌呤的碱基序列,典型的为5’-AGGAGGU-3’,位于起始密码子AUG前约10核苷酸处,此序列由Shine和Dalgarno发现,称SD序列。 SD序列和核糖体16S的rRNA的3’末端富含嘧啶碱基的序列互补,这种互补序列与mRNA对核糖体的识别有关。 原核mRNA代谢很快,半寿期几秒至十几分钟。 五、 rRNA的结构 rRNA占总RNA的80%左右。 功能:rRNA是构成核糖体的骨架,与核糖体结合蛋白一起构成核糖体,为蛋白质的合成提供场所。 大肠杆菌中有三类rRNA(原核) 5S rRNA 16S rRNA 23S rRNA 真核细胞有四类rRNA 5S rRNA 5.8S rRNA 18S rRNA 28S rRNA
图 原核核糖体(rRNA 部分)
图 真核核糖体(rRNA部分)
P346 图5-14 大肠杆菌 5S rRNA 结构 第四节 核酸的性质 一、 解离性质 多聚核苷酸有两类可解离的基团:磷酸和碱基能发生两性解离。 磷酸是中等强度的酸,碱基的碱性较弱,因此,核酸等电点在较低的pH范围内。 DNA等电点 4—4.5 RNA 等电点 2—2.5 RNA链中,核糖C’2-OH的氢能与磷酸酯中的羟基氧形成氢链,促进磷酸酯羟基氢原子的解离。 二、 水解性质 1、 碱水解 室温,0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解,得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物。 图
在相同条件下,DNA不被水解。这是因为RNA中C’2-OH的存在,促进了磷酸酯键的水解。 DNA、RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义。 DNA稳定 ,遗传信息。 RNA是DNA的信使,完成任务后降解。 2、 酶水解 生物体内存在多种核酸水解酶 RNA水解酶 RNase DNA水解酶 DNase 核酸外一切酶 核酸内切酶 最重要的:限制性核酸内切酶 三、 光吸收性 碱基具有共轭双键,使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收, λmax=260nm 1、 鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为1.8(1.65-1.85),若大于1.8,表示污染了RNA。 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚,则A260/A280比值明显降低。 2、 含量计算 1 ABS值相当于:50ug/mL双螺旋DNA 或:40ug/mL单螺旋DNA(或RNA) 或:20ug/mL核苷酸 3、 增色效应与减色效应 P347 图5-15 DNA的紫外吸收光谱
增色效应:在DNA的变性过程中,摩尔吸光系数增大 减色效应:在DNA的复性过程中,摩尔吸光系数减小。 四、 沉降特性(DNA) 不同构象的核酸(线形、环形、超螺旋),起密度和沉降速率不同,用Cs-Cl密度梯度离心就可以将它们区分开来,这一方法常用于质粒DNA的纯化。
P348 图5—16 Cs-Cl密度梯度离心纯化质粒DNA
相对沉降常数 线型双螺旋分子 1.00 松驰双链闭环 1.14 切刻双链环 1.14 单链环 1.14 线型单链 1.30 正超或负超螺旋双链环状 1.41 坍缩 3.0
五、 变性、复性及杂交 变性、复性是核酸的重要的物化性质,相对蛋白质来说,核酸可以耐受反反复复的变性、复性。这也是核酸研究技术的基础。 1、 变性 (1)、 变性: 核酸双螺旋区的氢键断裂,变成单链,不涉及共价键断裂。多核苷酸骨架上共价键的断裂称核酸的降解。 DNA的变性是爆发式的,变性作用发生在一个很窄的温度范围内。 P350 图5-18变性过程
热变性 因素 酸碱变性(pH小于4或大于11,碱基间氢键全部断裂) 变性剂(尿素、盐酸胍、甲醛) 260nm吸收值升高。 变性后 粘度降低,浮力密度升高。 二级结构改变,部分失活。 (2)、 熔解温度(Tm)或称熔点: DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。DNA的Tm一般在70—85℃之间。 浓度50ug/mL时,双链DNA A260=1.00,完全变性(单链)A260= 1.37当A260增加到最大增大值一半时,即1.185时,对应的温度即为Tm。 (3)、 影响DNA的Tm值的因素 ①DNA均一性 均一性高,熔解过程发生在很小的温度范围 内。 ②G-C含量与Tm值成正比,G-C含量高,则Tm越高,测定Tm,可推知G-C含量。。 G-C%=(Tm-69.3)×2.44
P351图5-19 图5-20 Tm值与GC含量的关系 ③介质中离子强度 其它条件不变,离子强度高,Tm高。 P351 图5-21 2、 复性 变性DNA在适当(一般低于Tm20—25℃)条件下,两条链重新缔合成双螺旋结构。 变性DNA在缓慢冷却时(快速冷却可防止复性),可以复性。DNA片段越大,复性越慢;DNA浓度越大,复性越快。 复性速度可用Co·t衡量。 Co为变性DNA原始浓度mol·L-1,t为时间,以秒表示。
P352 图5-22,不同DNA的复性时间。
A.1个核苷酸对(A.U) 图上查出Cot1/2=4×10-6mol.s/L 若浓度为Co=1.0m mol/L 则复性50%所需时间t=0.004秒 若要全部复性,Cot=10-4 t=0.1秒 B.E.coli 4.2×106碱基对 图上查出Cot1/2=10 mol.s/L 若浓度Co=1.0 umol/L则复性50%所需时间t=107秒,约115天。复性100%Cot=500 mol.s/L t=5×108秒,5758天。 对于E.coli ,4.2×106bp,浓度达到umol/L级时,浓度已很高。 复性机制:10-20bp成、拉链 3、 杂交(DNA—DNA、 DNA—RNA) 将不同来源的DNA混合加热,变性后,慢慢冷却使它复性。若这些异源DNA之间,在某些区域有相同的序列,则复性时会形成杂交分子。 第五节 核酸研究技术 一、 核酸的分离纯化 要求:尽可能保持其天然状态。 条件温和,防止过酸、过碱。 避免剧烈搅拌,抑制核酸酶。 1、 DNA分离纯化 真核DNA以核蛋白(DNP)形式存在,DNP溶于水或盐(1mol/L),但不溶于0.14mol/L Nacl中,利用此性质,可将DNP与RNA核蛋白分开,提取出DNP。 DNA核蛋白可用水饱和的酚抽提,去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。 2、 RNA的制备(重点介绍mRNA的分离、纯化) 用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀,上清中即为RNA核蛋白(RNP)。 去蛋白:盐酸胍、苯酚等 必须防止RNA酶对RNA的破坏。 二、 核酸的凝胶电泳 1、 琼脂糖电泳 ① 核酸分子的大小,迁移率与分子量的对数成反比 ② 凝胶浓度 ③ DNA的构象,超螺旋最快,线形其次,环形最慢。 ④ 电流,不大于5V/cm 2、 PAGE电泳 三、 限制性核酸内切酶(1979年发现) 1、 限制修饰系统 图
2、 II型核酸内切酶 核酸内切酶有I、II、III三种类型,其中II型酶在DNA克隆中十分有用。 II型酶的特点:限制和修饰活性分开,蛋白质结构是单一成分,辅助因子Mg2+,位点序列旋转对称(反向重复)。 II型酶的切割频率 识别位点 4 44=256 6 46=4096 8 48=65536
Not I GCGGCCGC 限制酶的命名:E.coRI 第一位: 属名E(大写) 第二、三位: 种名的头两个字母小写co 第四位: 菌株R 第五位: 罗马字,从该细菌中分离出来的这一类酶的编号。 同裂酶:来源不同的限制酶(名称自然不同),识别同样的核苷酸靶序列,产生同样的切割,形成同样的末端。 BamH: GGATCC 同裂酶 BstI 识别位点相同,切割位点相同,产生同样的粘性末端。 同尾酶:来源各异,识别的靶序列不同,但都产生相同的粘性末端。 BamHI:GGATCC 同裂酶:BstI GGATCC
同尾酶:BclI TGATCA BglII AGATCT
MboI GATC Sau3A GATC 星号活力:在一定条件下(低离子强度,碱性pH,或50%甘油),限制酶的特异性降低。结果,它的识别与切割所需的典型的核苷酸序列的数量和种类会发生变化。
例如 HindIII AAGCTT
四、 DNA物理图谱及构建 (限制酶切图谱、DNA酶切位点图谱) 在研究某一种DNA时,弄清该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的。建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础,末端标记法构建DNA物理图谱: (1)单酶完全降解和部分降解 (2)双酶降解
图 五、 分子杂交 1、 Southern Blotting P353 图5-23 DNA样品 酶切 电泳 变性 转膜 固定 杂交 洗涤 放射自显影 变性(NaOH 0.5mol/L) 转膜(NC膜) 固定(80℃,4-6h) 杂交(高盐浓度,68℃,几小时) Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析,确定特异性DNA序列的大小和定位。 可用DNA或RNA探针。 2、 Northern Blotting 研究对象是mRNA 检测可与探针DNA同源杂交的mRNA分子的存在,因而可以研究细胞内特定mRNA的产生,即特定基因的表达。 mRNA易形成局部二级结构,因此,总RNA或mRNA需在变性条件下电泳,乙二醛、甲醛可防止RNA形成二级结构。 3、 Western Blotting 是研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。 六、 DNA序列分析 (一) 化学裂解法(Maxam-Gilbert 法) DNA一级结构测定原理: 利用特异性的化学裂解法,制备出具有同一标记末端,而另一端是长度只差一个核苷酸的片段群,然后将此片段群在能够分辨长度只差一个核苷酸DNA片段的PAGE上分离。 一定浓度的特测片段 32P-GCTACGTA 特异性化学裂解 在A处:32P-GCT和32P-GCTACGT 在G处:32p-GCTA 在C处:32P-G和 32P-GCTA 在T处:32P-GC和32P-GCTACG 图
硫酸二甲酯特异切割:G 甲酸特异切割:G和A 肼在Nacl条件下切割:C 肼在无 Nacl条件下切割:T和C 32P *ACTTCGACAA 硫酸二甲酯: *ACTTC 甲酸: *P *ACTTC *ACTTCG *ACTTCGAC *ACTTCGACA 肼(有Nacl): *A *ACTT *ACTTCGA 肼(无Nacl): *A *AC *ACT *ACTT *ACTTCGA 从下往上读:CTACGTA 末端G不能读出。 (二) 双脱氧终止法 英国 Sanger 1955 确定牛胰岛素结构 1958 获诺贝尔化学奖 1980 设计出DNA测序法 1980 再获诺贝尔化学奖 合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。 图
胰岛素的基因工程:A链21a.a 63个核苷酸 B链30a.a 90个核苷酸 (三) 序列分析仪 四色荧光基团标记的ddNTP 七、 DNA合成(合成探针、引物、基因) 1、 化学合成——DNA合成仪 DNA固相合成(亚磷酸三酯法) 合成方向:3’ 5’端 5’-OH用二对甲氧三苯甲基(DMT)保护, 碱基上氨基用苯甲酸保护 3’-OH用氨基磷酸化合物活化
P353 合成过程
保护: 5’-OH、活化3’-OH、保护所有NH2 2、 DNA的酶合成——PCR 用DNA聚合酶I 必备条件: ①模板DNA(单链) ②引物 ③DNA聚合酶 ④dATP、 dGTP、dCTP、dTTP ⑤一定浓度的Mg2+ 链合成方向:5 ’ 3’端 新的DNA链合成,从引物DNA的3’-OH开始。 图
链的增长反应是引物DNA的3’-OH,对脱氧核糖核苷三磷酸的α-磷原子亲核进攻的结果。 化学合成:方向3’ 5’,不需DNA模板,不用酶。 生物合成:方向5’ 3’,需模板,引物,用酶。 上一页 [1] [2] 转帖于 医学全在线 www.lindalemus.com
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