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  生化笔记--沈同(适用第2版及第3版)第六章 核酸           ★★★ 【字体:
生化笔记--沈同(适用第2版及第3版)第六章 核酸
作者:未知 文章来源:医学全在线 更新时间:2006-7-17

 

P345  图5-12  tRNA的二级结构(三叶草模型)

1966年Crick对于tRNA能识别几种密码子的现象,提出碱基配对的“摆动学说”:
认为除A-U、G-C配对外,还有非标准配对,I-A、I-C、I-U,并强调密码子的5’端第1、2个碱基严格遵循标准配对,而第3个碱基可以非标准配对,具有一定程度的摆动灵活性。
四、 mRNA的结构
mRNA是从DNA上转录而来的,其功能是依据DNA的遗传信息,指导各种蛋白质的生物合成,每一种蛋白质都由一种相应的mRNA编码,细胞内 mRNA种类很多,大小不一,每种含量极低。
从功能上讲,一个基因就是一个顺反子,原核生物的mRNA是多顺反子,真核mRNA是单顺反子。
顺反子:是由顺反试验所规定的遗传单位,相当于一种蛋白质的基因。
1、 真核mRNA
(1)、 3’-端有一段约30-300核苷酸的polyA。
PolyA是转录后,经polyA聚合酶添加上,polyA聚合酶对mRNA专一。
原核mRNA一般无polyA。polyA与mRNA半寿期有关,新合成的mRNA,其polyA较长;而衰老的mRNA,其polyA较短。
polyA功能:
PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。
PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。
(2)、 5’-帽子帽子
5’末端的鸟嘌呤N7被甲基化,鸟嘌呤核苷酸经焦磷酸与相邻的一个核苷酸相连,形成5’-5’-磷酸二酯键。
P346   帽子结构

帽子的功能:
可抵抗5’核酸外切酶降解mRNA。
可为核糖体提供识别位点,使mRNA很快与核糖体结合,促进蛋白质合成起始复合物的形成。
2、 原核mRNA(多顺反子)
原核mRNA由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。没有5/帽子和3/polyA。
举列:MS2病毒mRNA,3569 b,有三个顺反子,分别编码A蛋白、外壳蛋白和复制酶三种蛋白质。

          图MS2病mRNA

5’端先导区中,有一段富含嘌呤的碱基序列,典型的为5’-AGGAGGU-3’,位于起始密码子AUG前约10核苷酸处,此序列由Shine和Dalgarno发现,称SD序列。
SD序列和核糖体16S的rRNA的3’末端富含嘧啶碱基的序列互补,这种互补序列与mRNA对核糖体的识别有关。
原核mRNA代谢很快,半寿期几秒至十几分钟。
五、 rRNA的结构
rRNA占总RNA的80%左右。
功能:rRNA是构成核糖体的骨架,与核糖体结合蛋白一起构成核糖体,为蛋白质的合成提供场所。
大肠杆菌中有三类rRNA(原核)
5S rRNA
16S rRNA
23S rRNA
真核细胞有四类rRNA
5S rRNA
5.8S rRNA
18S rRNA
28S rRNA

          图  原核核糖体(rRNA 部分)


          图   真核核糖体(rRNA部分)

P346  图5-14   大肠杆菌  5S rRNA  结构
第四节   核酸的性质
一、 解离性质
多聚核苷酸有两类可解离的基团:磷酸和碱基能发生两性解离。
磷酸是中等强度的酸,碱基的碱性较弱,因此,核酸等电点在较低的pH范围内。
DNA等电点  4—4.5
RNA 等电点 2—2.5
RNA链中,核糖C’2-OH的氢能与磷酸酯中的羟基氧形成氢链,促进磷酸酯羟基氢原子的解离。
二、 水解性质
1、 碱水解
室温,0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解,得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物。
         图

在相同条件下,DNA不被水解。这是因为RNA中C’2-OH的存在,促进了磷酸酯键的水解。
DNA、RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义。
DNA稳定 ,遗传信息。
RNA是DNA的信使,完成任务后降解。
2、 酶水解
生物体内存在多种核酸水解酶
RNA水解酶  RNase
DNA水解酶  DNase
核酸外一切酶
核酸内切酶  最重要的:限制性核酸内切酶
三、 光吸收性
碱基具有共轭双键,使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收,    λmax=260nm
1、 鉴定纯度
纯DNA的A260/A280应为1.8(1.65-1.85),若大于1.8,表示污染了RNA。
纯RNA的A260/A280应为2.0。
若溶液中含有杂蛋白或苯酚,则A260/A280比值明显降低。
2、 含量计算
1 ABS值相当于:50ug/mL双螺旋DNA
                  或:40ug/mL单螺旋DNA(或RNA)
                  或:20ug/mL核苷酸
3、 增色效应与减色效应
P347  图5-15  DNA的紫外吸收光谱

增色效应:在DNA的变性过程中,摩尔吸光系数增大
减色效应:在DNA的复性过程中,摩尔吸光系数减小。
四、 沉降特性(DNA)
不同构象的核酸(线形、环形、超螺旋),起密度和沉降速率不同,用Cs-Cl密度梯度离心就可以将它们区分开来,这一方法常用于质粒DNA的纯化。

      P348 图5—16  Cs-Cl密度梯度离心纯化质粒DNA

相对沉降常数
线型双螺旋分子                1.00
松驰双链闭环                  1.14
切刻双链环                    1.14
单链环                        1.14
线型单链                      1.30
正超或负超螺旋双链环状        1.41
坍缩                          3.0

五、 变性、复性及杂交
变性、复性是核酸的重要的物化性质,相对蛋白质来说,核酸可以耐受反反复复的变性、复性。这也是核酸研究技术的基础。
1、 变性
(1)、 变性:
核酸双螺旋区的氢键断裂,变成单链,不涉及共价键断裂。多核苷酸骨架上共价键的断裂称核酸的降解。
DNA的变性是爆发式的,变性作用发生在一个很窄的温度范围内。
P350  图5-18变性过程

          热变性
因素      酸碱变性(pH小于4或大于11,碱基间氢键全部断裂)
           变性剂(尿素、盐酸胍、甲醛) 
             260nm吸收值升高。
   变性后   粘度降低,浮力密度升高。
               二级结构改变,部分失活。  
(2)、 熔解温度(Tm)或称熔点:
DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。DNA的Tm一般在70—85℃之间。
浓度50ug/mL时,双链DNA  A260=1.00,完全变性(单链)A260= 1.37当A260增加到最大增大值一半时,即1.185时,对应的温度即为Tm。
(3)、 影响DNA的Tm值的因素
①DNA均一性   均一性高,熔解过程发生在很小的温度范围
内。
②G-C含量与Tm值成正比,G-C含量高,则Tm越高,测定Tm,可推知G-C含量。。
G-C%=(Tm-69.3)×2.44

P351图5-19     图5-20   Tm值与GC含量的关系
③介质中离子强度
其它条件不变,离子强度高,Tm高。
P351    图5-21
2、 复性
变性DNA在适当(一般低于Tm20—25℃)条件下,两条链重新缔合成双螺旋结构。
变性DNA在缓慢冷却时(快速冷却可防止复性),可以复性。DNA片段越大,复性越慢;DNA浓度越大,复性越快。
复性速度可用Co·t衡量。
Co为变性DNA原始浓度mol·L-1,t为时间,以秒表示。

P352  图5-22,不同DNA的复性时间。

A.1个核苷酸对(A.U)
图上查出Cot1/2=4×10-6mol.s/L
若浓度为Co=1.0m mol/L
则复性50%所需时间t=0.004秒
若要全部复性,Cot=10-4  t=0.1秒
B.E.coli  4.2×106碱基对
图上查出Cot1/2=10 mol.s/L
若浓度Co=1.0 umol/L则复性50%所需时间t=107秒,约115天。复性100%Cot=500 mol.s/L
t=5×108秒,5758天。
对于E.coli ,4.2×106bp,浓度达到umol/L级时,浓度已很高。 
复性机制:10-20bp成、拉链
3、 杂交(DNA—DNA、 DNA—RNA)
将不同来源的DNA混合加热,变性后,慢慢冷却使它复性。若这些异源DNA之间,在某些区域有相同的序列,则复性时会形成杂交分子。
第五节 核酸研究技术
一、 核酸的分离纯化
要求:尽可能保持其天然状态。
       条件温和,防止过酸、过碱。
      避免剧烈搅拌,抑制核酸酶。
1、 DNA分离纯化
真核DNA以核蛋白(DNP)形式存在,DNP溶于水或盐(1mol/L),但不溶于0.14mol/L Nacl中,利用此性质,可将DNP与RNA核蛋白分开,提取出DNP。
DNA核蛋白可用水饱和的酚抽提,去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。
2、 RNA的制备(重点介绍mRNA的分离、纯化)
用0.14mol/L Nacl使DNP沉淀,上清中即为RNA核蛋白(RNP)。
去蛋白:盐酸胍、苯酚等
必须防止RNA酶对RNA的破坏。
二、 核酸的凝胶电泳
1、 琼脂糖电泳
① 核酸分子的大小,迁移率与分子量的对数成反比
② 凝胶浓度
③ DNA的构象,超螺旋最快,线形其次,环形最慢。
④ 电流,不大于5V/cm
2、 PAGE电泳
三、 限制性核酸内切酶(1979年发现)
1、 限制修饰系统
         图

2、 II型核酸内切酶
核酸内切酶有I、II、III三种类型,其中II型酶在DNA克隆中十分有用。
II型酶的特点:限制和修饰活性分开,蛋白质结构是单一成分,辅助因子Mg2+,位点序列旋转对称(反向重复)。
II型酶的切割频率
识别位点 4       44=256
                6       46=4096
                8       48=65536

Not I    GCGGCCGC
限制酶的命名:E.coRI
第一位:      属名E(大写)
第二、三位:  种名的头两个字母小写co
第四位:      菌株R
第五位:      罗马字,从该细菌中分离出来的这一类酶的编号。
同裂酶:来源不同的限制酶(名称自然不同),识别同样的核苷酸靶序列,产生同样的切割,形成同样的末端。
BamH:  GGATCC       同裂酶 BstI
识别位点相同,切割位点相同,产生同样的粘性末端。
同尾酶:来源各异,识别的靶序列不同,但都产生相同的粘性末端。
BamHI:GGATCC
同裂酶:BstI GGATCC

同尾酶:BclI  TGATCA   BglII  AGATCT

MboI  GATC    Sau3A  GATC
星号活力:在一定条件下(低离子强度,碱性pH,或50%甘油),限制酶的特异性降低。结果,它的识别与切割所需的典型的核苷酸序列的数量和种类会发生变化。

例如  HindIII   AAGCTT

四、 DNA物理图谱及构建
(限制酶切图谱、DNA酶切位点图谱)
在研究某一种DNA时,弄清该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的。建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础,末端标记法构建DNA物理图谱:
(1)单酶完全降解和部分降解
(2)双酶降解

         图
五、 分子杂交
1、 Southern Blotting
P353 图5-23
DNA样品        酶切         电泳           变性         转膜          固定         杂交           洗涤              放射自显影
变性(NaOH 0.5mol/L)
转膜(NC膜)
固定(80℃,4-6h)
杂交(高盐浓度,68℃,几小时)
Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析,确定特异性DNA序列的大小和定位。
可用DNA或RNA探针。
2、 Northern Blotting
研究对象是mRNA
检测可与探针DNA同源杂交的mRNA分子的存在,因而可以研究细胞内特定mRNA的产生,即特定基因的表达。
mRNA易形成局部二级结构,因此,总RNA或mRNA需在变性条件下电泳,乙二醛、甲醛可防止RNA形成二级结构。
3、 Western Blotting
是研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。
六、 DNA序列分析
(一) 化学裂解法(Maxam-Gilbert 法)
DNA一级结构测定原理:
利用特异性的化学裂解法,制备出具有同一标记末端,而另一端是长度只差一个核苷酸的片段群,然后将此片段群在能够分辨长度只差一个核苷酸DNA片段的PAGE上分离。
一定浓度的特测片段
                       32P-GCTACGTA
特异性化学裂解
在A处:32P-GCT和32P-GCTACGT
在G处:32p-GCTA
在C处:32P-G和 32P-GCTA
在T处:32P-GC和32P-GCTACG
        图

硫酸二甲酯特异切割:G
甲酸特异切割:G和A
肼在Nacl条件下切割:C
肼在无 Nacl条件下切割:T和C
32P *ACTTCGACAA
硫酸二甲酯:   *ACTTC
甲酸:         *P
               *ACTTC
*ACTTCG
*ACTTCGAC
                *ACTTCGACA
肼(有Nacl):  *A
               *ACTT
               *ACTTCGA
肼(无Nacl):  *A    
*AC   
*ACT
                *ACTT
*ACTTCGA
从下往上读:CTACGTA
末端G不能读出。
(二) 双脱氧终止法
英国   Sanger
     1955  确定牛胰岛素结构
     1958  获诺贝尔化学奖
     1980  设计出DNA测序法
     1980  再获诺贝尔化学奖
合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。
         图

胰岛素的基因工程:A链21a.a   63个核苷酸
                  B链30a.a   90个核苷酸
(三) 序列分析仪
四色荧光基团标记的ddNTP
七、 DNA合成(合成探针、引物、基因)
1、 化学合成——DNA合成仪
DNA固相合成(亚磷酸三酯法)
合成方向:3’        5’端
5’-OH用二对甲氧三苯甲基(DMT)保护,
碱基上氨基用苯甲酸保护
3’-OH用氨基磷酸化合物活化

P353  合成过程

保护: 5’-OH、活化3’-OH、保护所有NH2
2、 DNA的酶合成——PCR
用DNA聚合酶I
必备条件:
①模板DNA(单链)
②引物
③DNA聚合酶
④dATP、 dGTP、dCTP、dTTP
⑤一定浓度的Mg2+
链合成方向:5  ’      3’端
新的DNA链合成,从引物DNA的3’-OH开始。
          图

链的增长反应是引物DNA的3’-OH,对脱氧核糖核苷三磷酸的α-磷原子亲核进攻的结果。
化学合成:方向3’     5’,不需DNA模板,不用酶。
生物合成:方向5’     3’,需模板,引物,用酶。

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