1983年Marshall和Warrer从慢性胃炎和消化性溃疡患者胃粘膜中分离出幽门螺杆菌（Hp)后，经研究表明Hp与慢性活动性胃炎关系密切，与消化性溃疡的顽固不愈、早期复发有关。国外已有两名志愿者口服Hp后引起活动性胃炎并出现消化不良症状。但对动物的感染较为因难，我国学者陈晶晶等于1991年报道了经口感染8只Wistar大鼠成功，我们在此基础上对Hp感染大鼠胃炎模型进行了进一步研究，并取得了较为满意的结果。
1 材料和方法
1.1 菌株
Hp菌株为本院胃镜室胃镜检查患者胃组织钳取物直接接种于空肠变曲菌选择性培基上，微需氧条件，37℃培养72h，检查菌落，革兰染色阴性杆菌，呈变曲或S型。尿素酶、氧化酶、过氧化氢酶试验阳性并传代培养，做为感染大鼠的Hp。
1.2 实验动物
Wistar大鼠32只，雌雄各半，5月龄，体重175g～256g。购于白求恩国际和平医院动物室。按体重编号，随机抽取8只做为空白对照。
1.3 感染方法
参照陈晶晶报道方法进行。①将24只大鼠禁食12～14h，先用胃管喂以5％NaHCO32ml，5min后和胃管注入从培养基上冲洗下的Hp菌液1.5ml（108～1010cfu)，30min后给食。每周感染1次，共4次。空白对照组不即予感染Hp，饲养条件同制模组。②于最后一次感染Hp后7d～10d，分将空白对照组8只大鼠和随机抽取模型组8只大鼠，禁食12～14h，用乙醚麻醉处死。用无菌生理盐水洗去胃内容物，从靠近幽门的不同部位，剪取胃粘膜组织4～5块，直接做尿素酶试验，直接涂片，其余的胃组织用福尔马林固定，常规制做病理切片，行HE和Warthin－Starry银染色，供病理学检查和Hp检测。用于电镜观察的标本用2.5％戊二醛固定。③感染结束后4周，再随机抽取8只模型鼠，按上述方法取胃粘膜组织，检测项目同上。④感染结束后8周，将所剩8只模型鼠按上述方法取胃粘膜组织，检测项目同上。
1.4 细菌学检查
①尿素酶试验：使用福建三强生物化工有限公司产SQ—H104半定量尿素酶试剂盒，按说明书操作及判定结果。②胃粘膜直接涂片检菌法：将大量鼠组织粘膜面在玻片上直接涂抹，涂匀后加热固定，革兰染色，镜检Hp。
1.5 病理学检查
将福尔马林固定的大鼠胃组织，石蜡包埋，切成6μm厚的组织切片，分别用HE和Warthin－Starry银染色，观察病理变化和检查组织切片中Hp。
1.6 电镜观察
将2.5％戊二醇固定的标本，用1％锇酸后固定，常规Epon812树酯包埋，半薄定位找到胃粘膜上皮细菌游离面，超薄切片厚50nm，常规铀一铅染色，JEM100csⅡ透射电镜观察。
1.7 Hp和炎细胞浸润程度分级标准
①Warthin－Starry银染色Hp检测分为A～D4级。A级：未见Hp；B级：偶见Hp；C级：Hp呈散在分布或成簇分布；D级：大量Hp。②中性粒细胞浸润分为0～3级。0级：未见中性粒细胞；1级：偶见中性料细胞；2级：中性粒细胞散在或成簇分布；3级：大量中性料细胞浸润。③淋巴细胞浸润分为0～3级。0级：未见淋巴细胞：1级：少量淋巴细胞；2级：淋巴细胞散在或成簇分布，3级：大量淋巴细胞。
2 结果
2.1 尿素酶试验与细菌学检查
①模型组于感染结束时和感染后4周，8只大鼠胃粘膜尿素酶试验全部阳性（分别为5例＋，3例++与4例+，4例++)；直接涂片镜检革兰染色均查到散在Hp。对照组均为阴性。②感染后8W8只大鼠7只尿素酶试验阳性（4例＋，3例++)，同时均查到Hp，对照组均为阴性。③胃粘膜组织切片Warthin－Starry银染色除感染结束后8W时除1例未找到Hp外，其他均找到Hp（表1)。主要分布于粘液层，粘膜上皮细胞表面和粘膜隐窝处。切片中呈变曲型，S型。对照组大鼠胃粘膜组织中未找到Hp。
表1 各Hp检出率（n)
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感染分级 |
模型组感染Hp |
对照组 | ||
|
结束时 |
结束后4周 |
结束后8周 | ||
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1 |
|
|
1 |
8 |
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2 |
4 |
5 |
4 |
|
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3 |
4 |
3 |
3 |
|
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4 |
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2.2 病理学检查
感染Hp大鼠的胃组织切片均有病变（表2)。对照组8只大鼠中仅3例可见少量淋巴细胞，1例可见少量中性粒细胞。炎细胞浸润特点：炎症分级中炎细胞浸润至粘膜细胞基膜附近；2级炎性细胞浸润至粘膜下层；3级炎细胞浸润至胃壁全层。此与人类慢性胃炎的炎细胞只浸润粘膜层有所不同。另外可见粘膜上皮细胞变性病灶，细胞肿胀而不规则，包浆内结构不清和消失，少数可见浆细胞和嗜酸细胞。
表2 各组炎性细胞浸润程度（n)
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浸润分级 |
模型组炎细胞浸润 | |||||||
|
结束时 |
结束后4周 |
结束后8周 |
对照组 | |||||
|
L |
N |
L |
N |
L |
N |
L |
N | |
|
0 |
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|
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|
|
1 |
5 |
7 |
|
1 |
3 |
2 |
3 |
3 |
4 |
2 |
3 |
1 |
|
2 |
4 |
4 |
4 |
2 |
3 |
3 |
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|
3 |
1 |
2 |
1 |
2 |
1 |
2 |
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2.3 电镜观察
经电镜观察有明显病变：上皮细胞游离面质膜粘裂或消失，胞质粘液颗粒减少或变性，粘液颗粒内容物变性，使颗粒有芯，犹如胃癌时出现的“蛙卵样”粘液颗粒，或变成低电子密度空泡。胞质内细胞器减少，呈空泡变性。细胞核畸形，严重者变性，染色质边集。粘膜内嗜酸细胞增多。一份标本粘液内有一菌体斜面，考虑为Hp。空白对照组无病变，胃粘膜上皮细胞质膜完整，腔面附有明显粘液层，细胞游离端胞质内充满粘液颗粒，细胞侧面连接复合体明显，胞质细胞器丰富，常见线粒体、内质网、核糖体等。胞核较规则常染色质较丰富。
3 讨论
我们仿照陈晶晶的感染方法，对Hp感染Wistar大鼠胃炎模型的制备进行了进一步的实验研究，采取较大剂量活跃菌株，多次重复感染方法获得成功。感染保持时间较长，感染后8周自然消失仅1例。研究结果表明：Hp对Wsitar大鼠尚属易感。感染后所出现的病理变化与人类Hp相关胃炎类似，既有淋巴细胞浸润又有中性料细胞浸润。而Lambert感染悉生仔猪所制成的模型中性粒细胞只现于贲门部的非腺体区，不连贯且保持时间较短。本研究所制备的Wistar大鼠胃炎模型，其感染率、重复性及感染后出现的炎症病变，均达到了做为Hp胃炎模型所需的指标。模型制做的成功，将对推动Hp致病机理、Hp相关性胃炎的防治等研究起到积极作用。
王丙信1 姚希贤2 白文元2
1解放军第251医院内科（张家口075000)
2河北医科大学附属二院内科（石家庄050017)
