四、原虫低温保存
用液氮保存原虫，具有保持原虫生物学特性，且保存时间较长的优点。现仅介绍疟原虫、弓形虫、人毛滴虫及阴道毛滴虫的低温保存方法。
1.冻存方法
恶性疟原虫：将从受染者采得的抗凝含虫血或体外培养的培养物，经1500rpm离心10分钟，加入与沉积细胞等量的24%二甲基亚砜（DMSO)生理盐水溶液（0.9%生理盐水或5%葡萄糖生理盐水76ml中加入DMSO24ml)保护剂，充分混匀后在室温中放置30分钟，按0.5～1.0ml分装入无菌安瓿（或塑料管)内，封口（或盖严)后将之放入标明批号的纱布袋中，装于液氮罐的提筒内，先置于液氮罐的颈部，该处约为-70℃，30分钟后，置液氮中（-196℃)冻存。
鼠疟原虫：从感染疟原虫第3～4天的小鼠心脏取血（或摘除眼球取血)，注入试管，肝素抗凝，加入等量的10%或15%DMSO及15%或20%小牛血清为保护剂；或加入等体积的甘油、山梨醇保护液（4.2%山梨醇生理盐水180ml加纯甘油70ml)，充分混匀。按照上法装管及冻存。也可以在1mm3阳性鼠血加0.1mm3的3.8%枸橼酸钠抗凝之后就装于液氮罐提筒中，立即直接置液氮中保存，2年内多数原虫仍有活力。
弓形虫：用无菌注射器吸取10%DMSO2ml，注入感染4天的小鼠腹腔，抽洗2次，抽出液混匀后即注入无菌塑料管内（0.5～1ml/管)，冻存法同上。
阴道毛滴虫：用无菌拭子取阴道分泌物，放入培养基中培养48小时，转种于RPMI-1640培基中2天。取含虫培养液经1000rpm/min离心10分钟，在沉淀中加入10%DMSO2ml，同上法分装及冻存。
人毛滴虫：取腹泻患者的含虫粪便培养于洛氏培养基中48小时，转种于洛氏培养基或RPMI-1640培养基中培养2天后计算虫数（达7×105)。加等量10%DMSO并加Tween-20于DMSO中。装管同上法。但冻存过程应先将小管置于-10℃中15分钟，移到液氮罐颈2分钟，再置入液氮中冻存。
上述所用的保护剂（液)均应经高压灭菌，保存于4℃冰箱。RPMI-1640配制50%DMSO，用时再稀释所需浓度，加15%或20%小牛血清，调pH至7.2。
2.复苏与观察在冻存1～2年，需要时从液氮罐中取出保种的小管，迅速投入37～40℃温水中，经4～5分钟即溶化。取冻存的鼠疟原虫和弓形虫分别经腹腔接种2只小鼠，每只0.2ml，观察致病情况；也可接种后4～5天分别取鼠血或腹腔液，作涂片，姬氏液染色，镜检原虫。两种毛滴虫可用同样方法复苏，但需经培养3～4天后，作涂片镜检活动滋养体，或染色观察。
