(三)DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质:
1.解链酶(helicase)
DNA开始复制时首先在起始点处解开双链,反应是在一种解链酶(helicase)的催化下进行的。解链酶需要ATP分解供给能量。大肠杆菌中DnaB蛋白就有介链酶活性,与随从链的模板DNA结合,沿5′→3′方向移动,还有一种叫做Rep蛋白和前导链的模板DNA结合沿3′→5′方向移动。解链酶的作用就是打开DNA双链之间的氢键。
2.单链结合蛋白:(single strand binding proteins,SSBP)
它与解开的单链DNA结合,使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解,保证了单链DNA做为模板时的伸展状态,SSBP可以重复利用(图16-8)。
图16-8 大肠杆菌DNA复制叉中复制过程简图
3.引发体的形成:
DNA复制起始的关健步骤是前导链DNA的合成,一旦前导链DNA的聚合作用开始,随从链DNA的合成也随着开始。由于前导链的合成是连续进行的,所以它的起始相对简单,而随从链的合成是不连续进行的,所以引发阶段比较复杂。大肠杆菌的引发前体由Dna B. Dna C和单链结合蛋白组成。
(1)引物酶(primase)
它是一种特殊的RNA聚合酶,可催化短片段RNA的合成。这种短RNA片段一般十几个至数十个核苷酸不等,它们在DNA复制起始处做为引物。RNA引物的3′桹H末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一个磷酸二酯键的位置。
(2)引发体(primosome)
高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合上来,共同形成引发体,引发体主要在DNA随从链上开始,它连续地与引物酶结合并解离,从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物,在引物RNA的3′桹H末端接下去合成DNA片段,这就是随从链不连续合成的开始。
三、DNA复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子:
DNA的复制实际上就是以DNA为模板在DNA聚合酶作用下,将游离的四种脱氧单核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP,简写为dNTP)聚合成DNA的过程。
这是一个非常复杂的酶促反应,需要许多种酶和蛋白质参与,现分别叙述它们在DNA复制中作用。
(一)DNA的聚合反应和DNA聚合酶
图16-9 DNA聚合酶的作用
1957年,Arthur kornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶Ⅰ,(DNa polymerase Ⅰ,简写DNA polⅠ)后来又相继发现了DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。(DNa polymerase Ⅱ,Ⅲ,简写DNA polⅡ,DNA polⅢ)实验证明大肠杆菌中DNA复制的主要过程靠DNa polⅢ起作用,而DNA polⅠ和DNA polⅡ在DNA错配的校正和修复中起作用。见表16-1。
这种酶的共同性质是:①需要DNA模板,因此这类酶又称为依赖DNA的DNA聚合酶(DNa dependent DNA polymerase, DDDP)。②需要RNA或DNA做为引物(primer),即DNA聚合酶不能从头催化DNA的起始。③催化dNTP加到引物的3′桹H末端,因而DNA合成的方向是5′→3′。图16-9。④三种DNA聚合酶都属于多功能酶,它们在DNA复制和修复过程的不同阶段发挥作用。由于DNA聚合酶Ⅰ是研究得最清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特点,所以我们着重介绍DNa polⅠ的作用并指出另外二种DNA pol的特殊性: