1.DNA聚合酶Ⅰ:
DNA polⅠ是由一条多肽链组成,分子量为109KD。酶分子中含有一个Zn++,是聚合活性必须的。
大肠杆菌每个细胞中约有400个酶分子,每个酶分子每分钟在37℃下能催化667个核苷酸参入到DNA链中,用枯草杆菌蛋白酶可将此酶水介成两个片段,大片段分子量为76KD,通常称为klenow片段,小片段为34KD。大小片段具有不同的酶活性。
(1)DNA聚合酶的5′→3′聚合活性:
这是DNA聚合酶最主要的活性,按模板DNA上的核苷酸顺序,将互补的dNTP逐个加到引物RNA3′桹H末端,并促进3′桹H与dNTP的5′桺O4形成磷酸二酯键,酶的专一性表现为新进入的dNTP必须与模板DNA碱基配对时才有催化作用,5′→3′聚合活性存在于klenow片段上(图16-9和图16-10)。
图16-10 DNA聚合酶催化的DNA链延长
(2)DNA聚合酶的3′→5′外切核酸酶活性:
这种酶活性的主要功能是从3′→5′方向识别并切除DNA生长链末端与模板DNA不配对而游离的核苷酸,这种功能称为校对功能,这是保证其聚合作用的正确性不可缺少的,因此对于DNA复制中极高的保真性是至关重要的。
(3)DNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性:
这种酶活性是从DNA链的5′端向3′末端水解已配对的核苷酸,本质是切断磷酸二酯键,每次能切除10个核苷酸。因此,这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起重要作用,对完成的DNA片段去除5′端的RNA引物也是必须的。
DNA polⅠ的5′→3′聚合活性和5′→3′外切酶活性协同作用,可以使DNA一条链上的切口从5′→3′方向移动,这种反应叫做缺刻平移(nick translation),利用此反应可在体外对DNA片段进行放射性磷(α-32PdNTP)的标记制成探针(probe),进行核酸的分子杂交实验,是现代分子生物学的一项重要技术(图16-11)。
图16-11 缺刻平移标记DNA探针
许多实验证实DNA polⅠ并不是DNA复制过程中的主要酶,它的作用主要与DNA损伤后的修复有关。
2.DNA聚合酶Ⅱ(DNA polⅡ)
此酶分子量为120KD,每个细胞约有100个酶分子,但活性只有DNa polⅠ的5%,它具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性,而没有5′→3′外切活性,它的作用可能与DNA损伤修复有关。医学全在线www.med126.com
3.DNA聚合酶Ⅲ(DNA polⅢ)
图16-12 DNA聚合酶Ⅲ催化先导链和随从的合成
这是在DNA复制过程中起主要作用的聚合酶,它是由一个多亚基组成的蛋白质分子,其分子量>600kDa整个酶分子形成一个不对称的二聚体,每个大肠杆菌细胞中只有10?0个酶分子,但催化dNTP参入DNA链的速率却是最快的,约为9000核苷酸/每分钟/每个酶分子。这也证明DNa polⅢ是DNA复制过程中主要发挥作用的酶。在大肠杆菌染色体DNA进行复制时,DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是单独起作用的,而是与引发体,介链酶等构成一个复制体(replisome)。由于复制体的存在,先导链和随从链可以同时复制。DNa polⅢ是由多亚基组成的不对称二聚体,它可能同时负责先导链和随从链的复制,在φ×174的复制中观察到引发体总是伴随着DNA噜噗(loop)的存在。图16?2可以看到,由于随从链的模板DNA在DNA聚合酶Ⅲ全酶上绕转了180°而形成一个噜噗,因此岗崎片段的合成方向能够与先导链的合成方向以及复制体移动方向保持一致。