2)酶解法肽谱重迭法
分析肽段也可采用酶解法，利用专一性不同的两种酶将一个肽分别断裂成更小的寡肽，比较两种方法所得之肽段的重复性，进行氨基酸顺序的装配。例如，有一个肽段，通过氨基酸组成分析已知其为十肽，假如先以糜蛋白酶水解，则得到一套寡肽，再以胰蛋白酶水解此十肽，得到另一套寡肽。分析结果如下：
Ala·Phe+Gly·Lys·Asn·Tyr+Arg·Trp+His·Val
糜蛋白酶水解
+肽(Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val)
胰蛋白酶水解
Ala·Phe·Gly·Lys+Asa·Tyr·Arg+Trp·His·Val
将此两套寡肽可以做分析比较，因为十肽的N末端及C末端已事先测定分别为Ala及Val，因此第一段寡肽必然是Ala,Phe。如此类推如下
| 寡肽号 | 氨基酸组成部分顺序 |
| A-1 | Ala·Pha |
| B-1 | Ala·Phe·Gly·Lys |
| A-2 | Gly·Lys·Asn·Tyr |
| B-2 | Asn·Tyr·Arg |
| A-3 | Arg·Trp |
| B-3 | Trp·His·Val |
| A-4 |
His·Val |
| 十肽顺序 | Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val |
水解酶也可运用二肽酶，两组可用同一种酶水解如第一套肽是A桞，C桪，E桭，G桯……第二套肽水解则先将该肽段N端切去一个末位氨基酸，然后再开始二肽酶断裂，结果是A，B桟，D桬，F桮……这样分析比较也可排列出肽段顺序。
5.二硫键定位
蛋白质分子不经任何处理，直接用酶水解，检出其中二硫键的肽段，然后将二硫键拆开，分别测定两个肽的顺序，将此两肽结构与测出的一级结构比较，就能找出相应的二硫键的位置。
含二硫键肽的检出方法。
1)凝胶过滤或离子交换层析：用以分离各肽段，然后用特殊的二硫键显色反应找出含二硫键的肽。
图1-21 对角线电泳技术图解
2)对角线电泳或层析：1966年Brown及Hartlay提出用对角线电泳进行含－S-S-肽的定位，此方法是将水解后的肽混合物进行第一相电泳，样品点在中间，电泳毕，将样品纸条剪下，置于装有过甲酸的器皿中，用过甲酸蒸气处理2小时，使-S-S-断裂，此时含-S-S-肽段的静电荷发生了改变。然后将纸条缝于另一张纸上，进行第二相电泳电泳，电泳条件与第一相相同，只是与第一次方向成直角。在第二相电泳中，那些不含-S-S-的髣民泳情况与第一相相同，因此电泳后各肽斑均坐落在纸的对角线上，而那些含-S-S-的肽由于被氧化，电荷发生变化，第二相电泳速度就与第一相不同，电泳结果这些肽斑就偏离对角线，肽斑可用茚三酮显示。对角线法由于其速度快，操作简便以及能用于小分子样品，是直接分离-S-S-肽的好方法。
含-S-S-肽被分离后，即可进行肽段顺序分析，并与已测定的该蛋白质的一级结构进行比较，即可找出相应的-S-S-位置，至此蛋白质的一级结构基本阐明。
今后蛋白质一级结构的测定正朝自动化、快速化及微量化发展，关键问题仍然是进一步寻找蛋白裂解和肽分离的方法。
蛋白质一级结构的测定不断有新方法和新思路出现，如X衍射法测定一级结构；分离相应蛋白质的mRNA，由mRNA的一级结构排出蛋白质的一级结构等。这些大胆的设想必将有助于蛋白质的一级结构测定，使人们掌握更多的工具和方法去探索生命的奥秘。
