免疫细胞化学与原位杂交组织化学结合法

　此种ISHH与ICC联合法稳定，实验周期短，蓝色与棕色反差强，是目前较好的ISHH与ICC结合法。详细程序如下：

　　（1)将切片漂浮于能经受高压灭菌的器皿中。0.1mol/l PBS pH7.2冲洗3×5min。

　　（2)0.1mol/L甘氨酸PBS冲洗5min。

　　（3)0.4% Triton X-100 PBS 15min。

　　（4)1μg./ml蛋白酶K（0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA 配)，37℃保温30min。

　　（5)4%多聚甲醛PBs 5min。

　　（6)PBS冲洗2×min。

　　（7)0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配)10min。

　　（8)2×SSC冲洗10min。

　　（9)将切片用灭菌吸水纸吸干，然后入杂交液。核酸探针浓度为0.25～0.5μg./ml。每一正常成年大鼠脑冠状切片15μl杂交液足够。43℃保温12～16h。

　　（10)4×SSc 37℃冲洗30min。

　　（11)2×SSC（含RNasea 20μg/ml)37℃保温30min。

　　（12)1×SSC和0.5×SSc 37℃分别冲洗30min。

　　（13)0.05mol/l PBS冲洗3×5min。

　　（14)0.5%H₂O₂ PBS室温20min。

　　（15)0.05mol/l PBS 冲洗2×5min。

　　（16)碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体（Fab)与抗蛋白或多肽等抗体混合液，前者一般1：1000稀释，后者则因抗体而异。稀释液：1%BSA，0.4%Triton X-100 ,0.05mol/L PBS pH7.2，4℃孵育24h。

　　（17)0.05mol/l PBS冲洗4×5min。

　　（18)二抗（1：100～1：200)37℃保温1h。

　　（19)0.05mol/l PBS冲洗3×5min。

　　（20)PAP（1：200～1：400)37℃保温1h。

　　（21)0.05mol/l PBS冲洗3×5min。

　　（22)DAB显色液（0.05%DAB + 0.03% H₂O₂,0.05mol/L PBS pH7.2配)显色5～10min。

　　（23)0.05mol/l PBS冲洗3×5min。

　　（24)TSM，冲洗2×5min（TSM₁：0.1mol/l Tris – HCl pH8.0,0.1mol/L NaCl,0.01mol/L MgCl₂).

　　（25)硝基四氮唑蓝（400μg/ml)和5-溴-4-3-吲哚磷酸（200μg/ml)混合液（TSM₂配显色混合液)显色1～3h，避光。

　　（26)20mmol/l EDTA终止显色。

　　（27)将切片贴于涂有铬矾明胶的载片上，空气干燥。

　　（28)梯度酒精脱水，透明、封片。

　　结果：ISHH阳性细胞的胞质呈紫蓝色，胞核不着色，示该细胞含XmRNA。ICC阳性细胞的胞质呈棕色，胞核不着色示该细胞含X多肽。双标记细胞的胞质为蓝棕混合色，示多肽与mR－NA共存于该细胞内。

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