cRNA探针在原位杂交组织化学中的应用

　　（二)培养细胞的原位杂交细胞化学方法

　　（1)固定：通常将细胞培养在盖玻片或塑料薄膜上，可将盖玻片取出，倾去培养液，用4%多聚甲醛液固定2～4h后，依组织切片处理法进行ISHH实验。也有在4%多聚甲醛室温固定20min后，由低浓度30%，50%，70%酒精各3min ，保留在新鲜配制的70%酒精中，4℃，备用。

　　（2)重回到水：50%，30%酒精3min，无菌重蒸水2×3min，然后置入PBS含5mmol/l MgCl₂ 10min，室温（配制法：200ml PBS, 1ml MgCl₂)。

　　（3)0.1mol/L甘氨酸/Tris pH7.4：室温10min(0.1mol/L 甘氨酸，0.2mol/l Tris（配制法：1.5mg甘氨酸和20ml Tris，应用重蒸水制成200ml)。

　　以后步骤同（一)组织切片法。

　　二、生物素标记cRNA探针在原位杂交组织化学中的应用

　　（一)光敏生物素标记cRNA探针的应用

　　以线性质粒DNA为模板合成未加标记物的cRNA探针，使其最终浓度为0.5～1.0μg/μl(500~1000ng/μl),再与等体积的光敏生物素（1μg/μl)混合。在150瓦卤素灯下，距离光源20cm处照射30min。用仲丁醇抽提游离生物素，再用丁醇沉淀回收光敏生物素cRNA探针，将其溶于适量的灭菌双蒸水，用紫外分光光度计测探针的光密度（详第十九章　)，其最佳工作浓度为2μg/ml。

　　切片的制作、预处理、预杂交、杂交和杂交后冲洗的方法同概述中基本方法一节　。

　　光敏生物素核酸探针原位杂交组化程序：

　　（1)石蜡切片脱蜡入水后，置0.1mol/l PBS pH7.2冲洗5min；冰冻切片直接入PBS冲洗5min。

　　（2)0.1mol/l 甘氨酸PBS冲洗5min。

　　（3)0.4%Trition X-100 PBS 冲洗15min。

　　（4)蛋白酶K1μg/ml（0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA配)37℃保温30min。

　　（5)4%多聚甲醛PBS固定5min。

　　（6)0.1mol/l PBS冲洗2×3min。

　　（7)0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制)10min。

　　（8)2×SSC冲洗10min（1×SSC：0.15mol/l NaCl, 0.015mol/L 柠檬酸钠)。

　　（9)取10μl含相应探针的杂交液滴于标本上，如果是cDNA探针则用前将探针于95℃水浴中保温10min，马上放入冰浴中冷却，然后再用。

　　（10)盖上22×22mm的硅化盖片或合适大小的蜡膜，入温盒43℃保温12～16h。

　　（11)4×SSC洗脱盖片，并在同一液中37℃漂洗10～30min。

　　（12)2×SSC（含20μg/mlRNaseA, 适于RNA探针)冲洗30min，37℃。

　　（13)1×SSC，0.1×SSC,37℃各漂洗10～30min。

　　（14)0.05mol/l PBS 冲洗4×5min。

　　（15)3%BSA（0.4%Triton X-100 PBS配)37℃保温30min。

　　（16)Avidin –AKP(碱性磷酸酶)（1：500～1：100，0.4%Triton X-100 PBS配)室温1～3h。

　　（17)0.05mol/l PBS冲洗4×5min。

　　（18)TSM₁冲洗2×5min。

　　（19)TSM₂冲洗2×5min。

　　（20)硝基四氮唑蓝（NBT)0.4%mg/ml 和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP)0.2mg/ml混合液显色，室温，暗处3h。

　　（21)20mmol/l EDTA,pH8.0终止显色。

　　（22)甘油明胶直接封片。

　　结果：杂交阳性部位着蓝黑色。

　　组织处理及预杂交所用器皿需高温消毒，实验者需戴手套。

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