（二)酶促生物素标记cRNA探针的应用
基本方法和放射性标记cRNA探针同，所不同的是探针浓度为2.5μg/μl。显示探针反应步骤如下。
（1)用PBS冲洗粘附有切片的载片2×3min。根据情况也可用漂洗法。
（2)将载片浸入0.3%H2O2在PBS或甲醇内30min以封闭内源性过氧化物酶。
（3)PBS冲洗2×3min，用吸水纸拭干切片周围的水份，加入小鼠抗生物素血清1：100和PBS含正常羊血清（1：30)，室温1h，或4℃过夜。
（4)PBS彻底冲洗。
（5)载片加生物素化抗小鼠IgG（1：100)30min室温。
（6)PBS彻底冲洗。
（7)应用ABC复合物与等量的1%牛血清白蛋白-PBS液混合孵育1h，室温。
（8)PBS彻底冲洗。
（9)将切片覆以新鲜配制的0.025%DAB溶液，0.02%H2O2,孵育3～15min。
（10)水洗，复染，脱水，透明和以甘油/PBS或DPX封固。如需要可用银染，多层ABC或PAP法加强染色效果。
三、地高辛标记cRNA探针的应用
（一)基本原理
地高辛（Digoxigenin 简写Digo-)又称异羟基洋地黄毒甙配基，这种类固醇半抗原仅限于洋地黄类植物，其抗体与其它任何固醇类似物如人体中的性激素等无交叉反应，地高辛配基标记于脱氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP)上形成digoxigenin –11-dUTP（图20-3)。通过随机引物或缺口翻译法（多用随机引物法)，将dig-11-dUTP与探针的核酸分子相连，构成Dig-配基标记的核酸探针。将这种标记的探针与组织、细胞或染色体原位核酸分子之间的同源序列在一定条件下互补杂交，然后用偶联有酶或荧光素的羊抗高地辛抗体Tab（抗原结合片段)结合物作为酶标或荧光标记，再分别用显色底物使杂交部位显色或产生荧光以达到检测目的，其反应过程见图20-3。
图20-3 地高辛标记的探针检测酶联免疫反应
常用的免疫酶学检测方法有两类：一是Dig –HRP（辣根过氧化物酶)检测体系，以DAB（四氢氯化二氨基联苯胺)/H2O2为底物，结果为棕色；或以4-氯-1-萘酚/H2O2为底物，结果为蓝色。另一是Dig –AKP检测体系：以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。与免疫细胞化学方法相似，如应用酶促反应会较单一信号的标记物如荧光素具有更高的灵敏度。同样是酶促化学反应，AKP灵敏度和分辨率较HRP高约10倍左右，但HRP的优点为价廉、稳定。
应用地高辛标记的核酸探针也较稳定，据报告在-20℃贮存可达2年，随时要取用，不像放射性标记探针有半衰期所致的时间限制。但在现实应用中，仍喜欢采用新鲜的地高辛配基标记3～6个月以内的核酸探针。为节 省核酸探针的用量，凡使用过的含有探针的杂交液也可反复多次使用，特别是对于已知的重复性实验。对于细胞或组织内未知mRNA的检测，仍宜采用未使用过的探针杂交液为佳。
与放射性标记相比，地高辛标记探针具有非放射性探针的优点，对人体无害，不受半衰期限制，探针可长期保存。与生物素标记探针相比，地高辛探针不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高。由于地高辛具有灵敏度及分辨率高，反应产物颜色鲜艳，反差好，背景染色低，制备探针可较长期保存，对人体无害等优点，已日益显示出它的优越性和广泛的应用前景。它不仅可应用于原位杂交细胞化学，还可应用于Southern印迹杂交法检测特定基因组序列，进行RFLP分析用于基因诊断，菌落原位杂交，噬菌斑原位杂交，固定细胞及中期染色体原位杂交以及生物体液中，组织中病毒DNA序列的检测。这一技术还被应用于检测DNA标记物及测序，对人类染色体连锁图谱进行构建和基因图谱分析。
