三、生物素-补骨脂素（Biotin -psoralen)标记法
生物素-补骨脂素是另一种生物素光敏物质，在长波长紫外线照射下与嘧啶碱基发生光化学反应，加成到DNA中，去除小分子后，得到生物素标记核酸探针。此法可标记单链或双链DNA或RNA，及寡核苷酸。灵敏度与放射性探针相当。标记方法：取DNA或片段0.5μg加50μlTE（pH8.0)缓冲液中，再加入5μlg生物素-补骨脂素，溶解后，置365nm紫外光下直接照射20min，距离5cm，加等体积TE，移入用TE平衡的Sephadex G—50 柱（高1.0cm)，离心法过柱，收集液体即为Bio –DNA探针。
四、生物素-α-氨基乙酸-N-羟基琥珀标记化学修饰的DNA法
此法是在亚硫酸盐催化下，生物素酰肼可置换寡核苷酸探针中胞嘧啶上的氨基，使生物素结合到DNA分子上而制成生物素化DNA探针。此法优点是采用通用试剂和技术，检出敏感。Vicied 等人指出DNA和RNA中胞嘧啶N-4位置在亚硫酸氢盐存在下可用乙二胺连接臂修饰，此过程也可能介导C-6位的磺酸盐组分。在合适的条件下，可有3%～4%的碱基被修饰。新鲜配制亚硫酸氢钠-乙二胺混合液，两者混合液含量分别为1mol/L和3mol/l （pH6.0)，加入对苯二酚，使终浓度为1mg/ml。将DNA用超声打成500～800bp长度的片段，煮沸法变性，取1份DNA与9份上述混合液混合，42℃水浴3.5h。用5mmol/L磷酸钠缓冲液（pH8.5)在40℃下充分透析，浓缩DNA，再溶于200μl 0.1mol/L磷酸钠缓冲液（pH8.5)，再加入4mmol/L生物素-ε-氨基乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺脂，室温反应2h，用含150mmol/l NaCl、1mmol/l EDTA的10mmol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0)在40℃下充分透析，纯化，-20℃保存。医学全在线www.med126.com
五、缺口平移法标记生物素DNA探针（二步法)
取HBV质粒DNA0.5μg,DNase I(SABC)2pg, 10×NBTμl，三蒸水补足体积至10μl，37℃，15min；加5mmol/l dATP dGTP dCTP Bio –11- dUTP各2μl，10×NBt 4μl，三蒸水补足体积至10μl,37℃，15min；三蒸水补足体积至49μl，DNA聚合酶i 5u，混匀，14℃过夜，加0.5mmol/l ED-TA(Ph8.0)1μl终止反应。
已标记探针的提纯：10mg/ml tRNA 2μl,10mmol/L Tris –HCl (pH7.5) 150μl,2.5倍体积的95%乙醇，置液氮中15min或-20℃过夜。15000r/min，离心10min，真空干燥后，溶于适量三蒸水中，即为纯化的探针，-20℃备用。
使用闭环或线性双链质粒DNA，或分离的双链DNA片段均可进行此法标记，全质粒标记敏感性较高，因为标记物可同时掺入载体DNA。
此法也可用于放射性同位素和地辛标记DNA法。
六、生物素随机引物标记探针方法
以HBV DNA为例。取HBv DNA质粒0.5μg，随机引物（Pharmacia)2μg，用TE（pH8.0)补足体积至10μl；100℃，热变性5min，骤冷10min。加10×缓冲液（500mmol/l Tris –HCl (Ph6.6),100mmol/L MgCl2, 10mmol/L β巯基乙醇)，BSa 500μg/ml 5μl，5mmol/l dATP/dGTP dCTP各1μl，按不同比例加入Bio –11-Dutp,和dTTP，用三蒸水补足体积至48μl，加DNA聚合酶（SABC)8u，混匀，37℃，2h，加0.5mol/l EDTA(Ph8.0)2μl，终止反应。
在随机引物标记体系中，加入不同梯度浓度比值的Bio-11-dUTP/dTTP(%)，发现二者比值明显影响探针标记率和显色灵敏度。Bio-11-Dutp/dTTP（%)比值为35%时，其标记率最高，显色灵敏度达0.2pg，杂交灵敏度为1～2pg。二步法缺口平移标记HBv DNA探针，其灵敏度低于随机引物标记。Mackeg等（Focus,1992；14：21)证实了用随机引物标记探针具有放大的效应。随机引物中加入一定比例的dTTP，能增加HBv DNA探针的标记率和灵敏度。其灵敏度接近同位素标记探针的灵敏度。
七、异羟基洋地黄毒甙（Digoxigenin)标记核酸探针
1988年德国Boehringer Manheims公司推出了一种地高辛标记DNA检测试剂盒。先将地高辛甙元通过一手臂联接至dUTP上，用随机引物法标记DNA制成探针。平均每20～25个核苷酸中标记一个地高辛甙元，然后用抗地高辛抗体的Fab片段与碱性磷酸酶的复合物和NBt – BCIP底物显色检测，灵敏度达0.1pg DNA，因此可做1μg哺乳动物DNA中单拷贝基因分析。此种探针有高度的灵敏性和特异性，安全稳定，操作简便，可避免内源性干扰，是一种很有推广价值的非放射性标记探针。
标记方法步骤：（1)取一小离心管（0.5ml)插入冰浴中，加入待标记DNa 1μg/5μl，95℃变性10min，迅速移入盐冰中3min。加入六核苷酸引物2μl，Dig-dNTP标记物2μl和消毒双蒸水10μl、大肠杆菌DNA聚合酶i Klenow片段1μl(单位)。（2)短时离心，37℃孵育至少60min（20h以内)。（3)加入2μl 0.2mol/L EDTA溶液中止反应。再加入2.5μl 4mol/L LiCl和75μl预冷的乙醇（-20℃)，放入-70℃至少30min或-20℃过夜。（4)离心（12000g)10min，弃上清，再加入70%乙醇（冷)40μl洗一次，离心，抽干，再溶于50μl TE溶液（pH8.0)中，分装，-20℃存放备用。
