放射性同位素标记核酸探针

　　最常用的同位素是α-³²PdNTP,³HdNTP,及³⁵SdNTP，多用缺品平移法、末端标记法，随机引物延伸法和反转录标记法。在以mRNA制备cDNA时，同时掺入标记的脱氧核苷酸，制出cD－NA标记探针。

　　一、缺口平移法

　　在适当的浓度的DNase I作用下在一双链DNA上制造一些缺口，再利用大肠杆菌DNA聚合酶I 的5’—3’外切酶活性依次切除缺口下游的核酸序列，同时将四种脱氧三磷酸核苷（其中一种用放射性标记)利用该酶5’—3’聚合活性补人缺口，使缺口逐个平称并在平移过程中形成标记的新生核酸链。此法也适用于探针的非放射性标记。如³²P标记DNA探针（缺口平移法)：反应体积为25μl，内含0.3μgDNA片段，4μl 0.2μmol/L dNTP, 1.1×10⁶Bq [α-³²P]dATP,1μl2万倍稀释的DNA酶和2μl DNA聚合酶I，6μl缓冲液[为50mmol/l Tris·HCl(PH7.2)、10mmol/l MgSO₄、1mmol/L二硫苏糖醇（DTT)和50μg/ml BSA]，反应在14_℃进行3h。标记DNA经Sephadex (G-50)柱层析回收。

　　二、末端标记法

　　在大肠杆菌T₄噬菌体多聚核苷酸激酶（T₄PNK)的催化下，将γ-³²P-ATP上的磷酸连接到寡核苷酸的5’末端上。要求标记的寡核苷酸5’端必须带羟基。反应式为：医学.全在线www.med126.com

　　此法适用于标记合成的寡核苷酸探针。如将底物改为Bio –11 –dUTP，也可以在3’端标记上一个生物素。

　　寡核苷酸³⁵S的3’—末端标记法：将下列液体依次加入Eppendorf管中。

寡核苷酸（1 pmol)1μl

10×Tailing buffer 2μl

　　[α-³⁵S]2μl

　　双蒸馏水14μl

　　末端脱氧核苷酸酶1μl（10Unit)

　　混合后，置于37^℃水浴中1.5h。取出反应管放入冰水中5min。加入下列液体：

　　TRNA(25mg/ml)3μl

　　1×TE(pH8.0)180μl

　　酚100μl

　　CTAa 100μl

　　充分混合2min。离心15000r/min 5min。将上清液（约200μl)移入新的Eppendorf 管中，然后加入下列液体：

4mol/L醋酸胺100μl

100%酒精800μl

　　混匀，置冰浴中，15min。再15000r/min离心10min，在管底可见一白色沉淀块（含tRNA及寡核苷酸)。吸去管中液体，然后加入1000μl80%酒精，混合1～2min同上离心，吸除酒精（勿破坏沉淀块)，将管置于40℃温箱中5min。加入适量的1×TE（pH8.0)及0.5mol/l DTT溶解沉淀。标记探针的最终浓度是0.5ng/μl,DTT的最终浓度为20mmol/μl。取出1μl标记探针测定比放射性，应在1.0×10dpm/μg以上。保存在-80℃中1～2个月。再次使用时应考虑到放射性同位素的衰减量。

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