三、应用特异单引物法标记DNA探针
应用探针DNA上的一个片段作为DNA引物，以环化探针DNA的重组质粒DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，通过变性，退火和延伸过程，使探针DNA得到标记。反应在0.5ml离心管内进行，总体积为25μl，内含50mmol/l Tris—HCl pH7.5, 10mmol/L MgCl2、BSa 5mmol/L、80ng引物DNA和0.1μg连接的DNA或0.1μg质粒。反应管在95℃变性5min，取出，稍离心，立即放入37℃C水浴保温2min使DNA退火，加入1UE.coli DNA聚合酶I，在37℃进行延伸反应。对环化基因，延伸18min，对质粒DNA延伸35min重复上述变性、退火和延伸过程1次。
四、双引物法标记DNA探针法
反应在0.5ml管内进行，反应体积为50μl，内含50mmol/l Tris(pH7.5)、10mmol/l Mg－Cl2、10mmol/L β-巯基乙醇和500μg BSA/ml，引物片段1和2各90ng，模板DNA0.1μg,[α-32P]dCTp 1.5×106Bq，dATp 、dGTP和dTTP各200μmol/L。标记反应包括3个步骤：
（1)变性：反应管在95℃水浴5min，然后离心；
（2)退火：37℃水浴2min；
（3)延伸：加入DNA聚合酶i 1u，37℃水浴18min。重复上述变性、退火、延伸过程1～2次，分别进行其标记率测定：取0.5μl反应液分别点于两张滤纸片上，烤干。一张经0.6mol/L三氯醋酸（TCA)、0.3mol/l TCA依次洗涤，每次10min，然后再用无水乙醇，醇醚混合液和乙醚洗涤各5min。两张滤纸分别放入闪烁瓶内，测定cpm值，达到108cpm/μg DNA以上。
五、聚合酶链反应（PCR)标记高活性DNA探针
在0.5ml离心管内进行，反应总体积为50μl，内含模板DNA350ng,DNA引物各50pmol/L,dGTP、dCTP和dTTP各200μmol/L，[α-32P]dATp 1.1×106Bq，反应缓冲液为67mmol/l Tris—HCl pH8.8含2.5mmol/l MgCl2、6.7mmol/L(NH4)2SO4、10mmol/l β-巯基乙醇、170mg/l BSA、6.7μmol/l EDTA和40μl/ml二甲亚砜。将反应管置于95℃水浴变性5min取出，加入Taq DNA聚合酶0.5～2u,在旋涡混合器上混匀简单离心一下，加入35μl石蜡油。放入65℃水浴2min，取出，立即进入PCR循环：91℃变性30s,51。C退火1min，68℃延伸2min。重复上述过程15次。最后将反应管置65℃水浴5min。反应完成，加入酵母tRNA10μg。分别测定参入和游离放射性计数，参入率为97.4%。标记DNA探针经醋酸钠酒精沉淀回收。将沉淀溶于10mmol/l Tris—HCl 、EDTA(pH8.0)100μl。用PCR方法标记的DNA探针特异性高，敏感性好，可测出的最低靶DNA量为10fg,利用PCR还可以作DNA探针的非放射性标记。
