胃肠道粘膜T淋巴细胞

　　一、T淋巴细胞分布及其特点

　　胃肠道T淋巴细胞分布在上皮层、固有层、粘膜集合和散在淋巴滤泡及肠系膜淋巴结内。随着免疫细胞化学技术广泛应用和各类T细胞亚群单克隆抗体的制备成功，为进一步研究不同部位T淋巴细胞的分类和功能起极其重要的作用。

　　1．上皮内T淋巴细胞上皮内淋巴细胞（intraepithelial lymphocyte, IEL)是指位于上皮层基底部的T淋巴细胞。近年来，对IEL对邻近上皮细胞有压迹，位于两个上皮细胞交界处，并未进入上皮细胞内。近年来，对IEL研究非常深入。已经证实75%以上成人小肠IEL是TCRγαβ阳性细胞，说明它们来源于胸腺，接受过抗原刺激。其中大部分为诱导、杀伤性T淋巴细胞（CD₈或OKT₈阳性)，10%左右为CD₇阳性和CD₃阴性的IEL，类似NK细胞，有细胞毒作用，但无NK细胞标记，对NK的靶细胞无破坏作用。10%～20%左右为TCRδ阳性IEL，不受胸腺的影响，其中70%CD₄和CD₈均阴性，为T淋巴细胞前体。说明人的部分IEL通过胸腺外途径进行分化。内毒素等腔内抗原与肠上皮细胞微绒毛、肠腺隐窝细胞、巨噬细胞和树突状细胞膜上的组织相关性抗原分子（鼠为MHL-II，人为HLA-DR、HLA-DP和HAL-DR)相结合后，将抗原分子传递到CD₃阳性T淋巴细胞受体（t lymphocyte receptor, TCR)中的α和β亚单位可变区进行结合，在CD₈分子作用下导致IEL增殖和分泌大量γ-干扰素（γ-INF)，α-肿瘤坏死因子（α-TNF)，和少量的白介素-2（IL-2)，发挥细胞毒性作用，调节　上皮细胞再生和增强对食物抗原的耐受。

　　2．固有层T淋巴细胞固有层T淋巴细胞（lamina propria lyphocyte, LPL)分散在固有层，约占固有层免疫细胞总数10%左右。其中CD₄阳性细胞（CD₄LPL)显著多于CD₈阳性细胞（CD₈LPL)。40%CD₄LPL表达CD₄₅RO抗原，能产生大量IL-2、IL-4和γ-INF，为记忆性T淋巴细胞，能辅助B细胞转化成抗体产生细胞并促其分泌抗体。60%CD₄LPL表达CD₄₅RA和CD₈抗原，能直接抑制抗体产生细胞转化和分泌。这两种细胞的比例在调节　抗体分泌中起着重要作用。CD₈LPL也可以分两种：一种表达CD₂₈抗原的LPL，能通过ADCC或直接溶解靶细胞。另一种表达CD₁₆抗原，具有自然杀伤功能。LPL能被IL-2激活，激活的LPL能释放大量IL-2、IL-4、γ-INF和IL-5、IL-2又能激活LPL，起着自身分泌作用。IL-5能促进抗体产生细胞分泌抗体。

　　3．胃肠道相关淋巴组织T淋巴细胞胃肠道相关淋巴样组织（gut – associated lymphoid tissue, GALT)主要包括肠系膜淋巴结和粘膜中集合和散在淋巴滤泡。GALTT淋巴细胞多们于生发中心的外周部位，约占40%。其中CD₈和CD₄阳细胞比例与周围血相似。动物研究证明，肠系膜淋巴结内的CD₄阳民生细胞多于固有层。分子生物学研究发现GALTT淋巴细胞含有IL-4和IL-5基因，激活后产生大量IL-4和IL-5，能特异性增加B和T淋巴细胞增殖。抑制B淋巴细胞分化。其表面糖蛋白主要为CD₄₅RA和leu₈(CD₈)，证明是幼稚T淋巴细胞。它们对抗原刺激的增殖反应低，对刀豆素A等有丝分裂促进剂的增殖反应高，产生IL-2和γ-INF低，辅助作用弱。GALTT淋巴细胞如何调节　B淋巴细胞转化成IgA产生细胞和其它免疫细胞的增殖及功能，并不十分清楚。有待进一步研究。

　　近年研究发现，除M细胞和巨噬细胞外，胃肠上皮细胞在接受和传递抗原中也起重要作用。免疫细胞化学发现正常小肠上皮细胞微绒毛和侧膜有斑片状MHc II类抗原，人小肠为HLA-DR糖蛋白，能识别、加工和传递抗原使粘膜内T淋巴细胞产生免疫反应。HLA-DR表达受γ-IFN诱导。因此免疫反应中组织相关性抗原与IEL和LPL淋巴细胞互相进行调节　。医学全在.线www.lindalemus.com

　　二、研究方法

　　1．组织切片中T淋巴细胞80年代以前多用玫瑰花瓣试验和酸性酯酶方法进行组织切片中T淋巴细胞研究，特异性较差。近年来多用OKT，Leu或CD等系列T淋巴细胞单克隆抗体进行研究，特异性高，可以分类出各种亚群。免疫组化染色中应注意以下几个方面：

　　（1)抗体的选择：根据不同目的选择相应的抗体，如要对人胃肠道组织进行研究，可选用OKT系统单抗；对鼠类等进行研究可选用Leu 或Thy系列。如要研究辅助性T淋巴细胞可用OKT₄或CD₄；研究抑制性T淋巴细胞可用OKT₈或CD₈等单克隆抗体。

　　（2)组织加工方法选择：目前所研究的特异性T淋巴细胞抗原决定簇多位于细胞膜上，用陈旧或普通组织固定和加工方法可能使抗原破坏，应采用新鲜组织和低温处理。具体方法是：手术或活检获得的组织立即用液氮冷冻，或用OCT复合物包埋后再放入液氮中，便于切片，Cryostat冰冻切片后室温下风干，用4^℃纯乙醇或丙酮固定10min，PBS冲洗后即可进行免疫细胞化学染色。

　　（3)染色方法的选择：因抗原较微量，而且位于细胞膜，应采取敏感性强、特异性高、非特异性着色少的方法。虽然有报道采用间接荧光或间接酶标技术也能显示特异性T淋巴细胞，我们推荐最好采用PAP或ABC染色技术。具体方法参阅第三，四章　。

　　2．粘膜分离液中T淋巴细胞一定重量粘膜组织中分离出来的T淋巴细胞也可以用免疫细胞化学进行定量和定性研究。下面介绍用间接免疫荧光技术研究IEL的大致过程：

　　（1)将手术取得的肠管纵形剪开，将上皮层与固有层分离。

　　（2)上皮层放在无镁离子、含100U青霉素和链霉素及0.2%叠氮纳的PB中清洗，无血液和其它杂质后用解剖剪将组织剪碎，用匀浆器磨碎或用超声粉碎或用胶原酶溶解上皮细胞。

　　（3)匀浆液通过脱脂棉、尼龙筛（只允许淋巴细胞滤过，除去粘液、碎屑和上皮细胞凝集块)或金属网（200目)获得淋巴细胞悬液。

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