3．双染色分析游标设立和荧光校正
（1)游标的设立：游标设立的原理和单染并无不同，但具体要用二维点图和二维等高图来完成。分别选用GFL和RFL为X和Y轴。先用不染色细胞测试，将阴性细胞集中在左下角（图10-13)。分别为X、Y轴设立游标，再用MsIg的阴性对照测试。可将X、Y轴游标略为移动，使位于窗“3”内的细胞（阴性)在95%以上。
（2)红、绿荧光的校正：由于红色荧光探测器在最佳测试状态时，会让部分绿色荧光进入红色荧光探测器。这是因为一部分细胞发出的绿色荧光波长较长。若用阻断或滤色的办法消除进入红荧光探测器的这部分GRL，就会大大地降低RFL探测器的灵敏度。因而只好在操作时，通过电子计算机预先进入荧光校正，在RFL中适当扣除GRL的影响。
通常红色荧光进入绿色荧光探测器的情况比较光见，图10-14给出CD11-PE（T细胞、RFL)及CD8-FITC（T抑制细胞，GFL)双染细胞在二维等高图上进行荧光校正的示意图。X轴为GFL，Y轴为RFL，由X轴Y轴游标划分的四个窗的阴阳性和图10-13相同。各窗给出的百分数为该细胞群所占百分比。图A表示未经校正时的情形。窗“2”内31.46%表示双阳性细胞，即在T细胞中31.46%为抑制细胞毒细胞。经过适当校正，可见有两群阳性双标记细胞出现（B图)。高强度部分为真正的CD8、CD11双标记阳性细胞；低强度部分属于CD8绿色阳性细胞（NK细胞)。此时“2”窗中细胞份额减为7.59%。需要指出的是校正过度则会使各区的阳性细胞都减少（图C)。
图10-13 双染色二维点图上游标的设置
1区：红色荧光阳性；2区 ：红、绿荧光均为阳性；3区：阴性细胞：4区：绿色荧光阳性细胞
图10-14双染色在二维等高图上荧光校正
双染色的荧光校正是用电子补偿电路来完成的。补偿时先测定一种染料的荧光，此时除了应该接收该荧光的光电倍增管PMT1有信号输出外，另一光电倍增管PMT2也常会有微弱输出。调节 补偿器使PMT2的输出为0；然后再测另一种波长的荧光染料，调PMT１的补偿器使之输出也为0；然后再测另一种波长的荧光的染料，调PMT1的补偿器使之输出也为0：如此反复调节 ，使两种荧光的探测器都获得补偿。实际调节 时用的是一种标准荧光微球，微球上标有已知数量的荧光分子。利用不同的微球可调整、补偿不同荧光的测量通道。需要指出的是：当PMT高压有所改变、激光和滤片系统有所变动时，都要对荧光校正做重新补偿调节 。
