放射免疫分析时加入的抗原和抗体的量极微，反应所形成的复合物并不能成为肉眼所能辨认的不溶性沉淀物，但是放射免疫分析必须分别测量与抗体结合的（B)和游离的（F)抗原，所以，B、F的分离是放射免疫分析中的一个重要环节 。根据抗原—抗体复合物与游离抗原理化性质或免疫学性质的不同，可采取各种分离技术。
一、对分离方法的要求
分离方法的选择直接影响分析的质量，通常需满足以下要求：
①使B和F分离完全；②不受外界因素的干扰而影响分离效果；③与游离抗原的非特异性作用尽可能小；④操作简便，分离迅速，重复性好，适用于大量样品分析；⑤来源广，价格低廉，便于使用，适合RIA技术自动化。
二、常用的分离方法
目前用于放射免疫测定中的分离方法很多，各有其优缺点，下面介绍几种常见的分离方法：
（1)吸附分离（固相颗粒)
活性碳吸附剂（目前常用)
硅镁吸附剂（滑石粉等)
交换树脂吸附剂
（2)蛋白沉淀剂
硫酸铵、硫酸钠
聚乙二醇（PEG)（目前常用)
无水乙醇、丙醇等
（3)免疫分离剂（第二抗体)
（4)磁性分离剂
磁化活性碳吸附剂
磁化固相抗体
（5)固相包被分离法（固相分离剂包被在测试管内)
（一)吸附分离法
这种吸附分离剂是固相颗粒，它可以从反应液中吸附游离抗原。
活性炭是常用的吸附剂。活性炭多用于小分子游离抗原和抗原—抗体复合物的分离。具体应用时在活怀炭颗粒的表面涂上一层右旋糖酐或蛋白类化合物。这样活性炭末的表面构成一定大小的孔洞，在反应液中加入这种特殊颗粒的混悬液时，小分子的游离抗原被活性炭吸附，达到分离B与F的目的。医学全在线www.med126.com
活性炭吸附方法的优点是操作简便、价廉，缺点是离心沉淀部分是F而不是B，不适用目前自动化放免测定，分离时易受温度和时间的影响。
（二)沉淀分离法
沉淀分离法的原理，是盐类或有机溶剂能够破坏蛋白质分子表面的水化层而发生沉淀（这种分离要求蛋白质分子处在等电点环境中)。常用的沉淀剂是聚乙二醇（PEG)。PEG是一种直链大分子聚合物，使用PEG溶液时分离沉淀是在有载体血清蛋白或丙种蛋白存在，而且要求γ球蛋白的最终浓度达250mg/ml以上的情况下才能实现。PEG沉淀的结果易受过量的脂类或离心温度的变化影响，PEG离心温度在20℃以下进行。PEG沉淀的优点是PEG价格低廉，操作简便，一次可处理大量样品。其缺点是PEG单独使用时非特异结合高，所以常与其它方法联合使用；其分离效果易受pH、温度等影响。
（三)双抗体分离法
双抗体分离法也称免疫分离法，是特异性分离，应用十分普遍。本法是以抗IgG抗体和可溶性的抗原-抗体复合物结合，形成很大的复合物而沉淀。很多抗原的特异抗体来自家兔或豚鼠，称为第一抗体，形成的复合物不能通过离心将其沉淀。或将第一抗体的同种正常动物的血清IgG免疫另一种动物所制得的抗体为第二抗体，该抗体与第一抗体形成不可溶的复合物，经离心可将其沉淀，从而达到分离的目的（图8-6)。
图8-6 双抗体法分离原理模式图
第二抗体分离的优点是重复性好，B和F分离较为完全，非特异结合低，可同时处理大量样品，使用方便。缺点是分离时间长，非特异性结合可有较大的波动，第二抗体用量较大。
