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您现在的位置: 医学全在线 > 理论教学 > 基础学科 > 免疫细胞与核酸分子杂交 > 正文:结合和游离部分的分离
    

放射免疫分析结合和游离部分的分离

  放射免疫分析时加入的抗原和抗体的量极微,反应所形成的复合物并不能成为肉眼所能辨认的不溶性沉淀物,但是放射免疫分析必须分别测量与抗体结合的(B)和游离的(F)抗原,所以,B、F的分离是放射免疫分析中的一个重要环节 。根据抗原—抗体复合物与游离抗原理化性质或免疫学性质的不同,可采取各种分离技术。

  一、对分离方法的要求

  分离方法的选择直接影响分析的质量,通常需满足以下要求:

  ①使B和F分离完全;②不受外界因素的干扰而影响分离效果;③与游离抗原的非特异性作用尽可能小;④操作简便,分离迅速,重复性好,适用于大量样品分析;⑤来源广,价格低廉,便于使用,适合RIA技术自动化。

  二、常用的分离方法

  目前用于放射免疫测定中的分离方法很多,各有其优缺点,下面介绍几种常见的分离方法:

  (1)吸附分离(固相颗粒)

  活性碳吸附剂(目前常用)

  硅镁吸附剂(滑石粉等)

  交换树脂吸附剂

  (2)蛋白沉淀剂

  硫酸铵、硫酸钠

  聚乙二醇(PEG)(目前常用)

  无水乙醇、丙醇等

  (3)免疫分离剂(第二抗体)

  (4)磁性分离剂

  磁化活性碳吸附剂

  磁化固相抗体

  (5)固相包被分离法(固相分离剂包被在测试管内)

  (一)吸附分离法

  这种吸附分离剂是固相颗粒,它可以从反应液中吸附游离抗原。

  活性炭是常用的吸附剂。活性炭多用于小分子游离抗原和抗原—抗体复合物的分离。具体应用时在活怀炭颗粒的表面涂上一层右旋糖酐或蛋白类化合物。这样活性炭末的表面构成一定大小的孔洞,在反应液中加入这种特殊颗粒的混悬液时,小分子的游离抗原被活性炭吸附,达到分离B与F的目的。医学全在线www.med126.com

  活性炭吸附方法的优点是操作简便、价廉,缺点是离心沉淀部分是F而不是B,不适用目前自动化放免测定,分离时易受温度和时间的影响。

  (二)沉淀分离法

  沉淀分离法的原理,是盐类或有机溶剂能够破坏蛋白质分子表面的水化层而发生沉淀(这种分离要求蛋白质分子处在等电点环境中)。常用的沉淀剂是聚乙二醇(PEG)。PEG是一种直链大分子聚合物,使用PEG溶液时分离沉淀是在有载体血清蛋白或丙种蛋白存在,而且要求γ球蛋白的最终浓度达250mg/ml以上的情况下才能实现。PEG沉淀的结果易受过量的脂类或离心温度的变化影响,PEG离心温度在20以下进行。PEG沉淀的优点是PEG价格低廉,操作简便,一次可处理大量样品。其缺点是PEG单独使用时非特异结合高,所以常与其它方法联合使用;其分离效果易受pH、温度等影响。

  (三)双抗体分离法

  双抗体分离法也称免疫分离法,是特异性分离,应用十分普遍。本法是以抗IgG抗体和可溶性的抗原-抗体复合物结合,形成很大的复合物而沉淀。很多抗原的特异抗体来自家或豚鼠,称为第一抗体,形成的复合物不能通过离心将其沉淀。或将第一抗体的同种正常动物的血清IgG免疫另一种动物所制得的抗体为第二抗体,该抗体与第一抗体形成不可溶的复合物,经离心可将其沉淀,从而达到分离的目的(图8-6)。

图8-6 双抗体法分离原理模式图

  第二抗体分离的优点是重复性好,B和F分离较为完全,非特异结合低,可同时处理大量样品,使用方便。缺点是分离时间长,非特异性结合可有较大的波动,第二抗体用量较大。

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