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您现在的位置: 医学全在线 > 理论教学 > 基础学科 > 免疫细胞与核酸分子杂交 > 正文:放射性碘标记
    

RIA中放射性碘标记

 

  常用的标记方法有:

  (一)氯胺T法

  氯胺T法标记效率高、重复性好、试剂便宜易得,是目前使用最多的碘标记方法。

  1.原理氯氨—T(Chloramine--T)是一种温和的氧化剂,在水溶液中产生次氯酸,可使碘阴离子氧化成碘分子。这活性碘可取代肽链上酪氨酸苯环上羟基位的一个或两个氢,使之成为含有放射性碘化酪氨酸的多肽链。

  2.方法以125I—AVP的制备为例。

  (1)碘化反应:AVP5μg+0.5mol/l PB50μl(pH7.5)+1251800μCi,混合后,加入新配置的Ch—t 30μg/15μl(0.05mol/l PB, pH7.5)。迅速振荡混匀,室温下反应40s。

  (2)终止碘化反应:加入还原剂偏重亚硫酸钠40μg/20μl(0.05mol/l PB, pH7.5),以终止碘化反应。

  (3)Bio—Gel P2层析纯化:将碘化反应混合液注入Bio—Gel P2柱,用0.1n HAC溶液洗脱,分部收集,每2min收集一管,共收集60管。

  (4)放射性测量:测定各收集管的放射性,出现两个峰,第一峰为125I—AVP,第二峰为游离碘盐峰。第一个峰中计算最高的几管,留下备用。

  为了解标记抗原的质量,每次碘标记后应计算出碘的利用率,标记上多少放射性碘,以及每微克抗原结合上多少放射性碘。

  (5)标记抗原的贮存:经纯化与检查后的标记物、加入1/8体积的异丙醇,分成若干小份,置于罐中,在-20℃以下的冰箱中贮存备用,应避免反复冻融。标记抗原在贮存中是不稳定的,这是因为:一是脱碘,标记的碘从原来位置上脱落,变成游离碘;二是蛋白损伤、变性,成为聚合大分子或断键成小分子碎片。由于上述原因,使B/F明显降低,标准曲线斜率变小,以致不能使用,故需分离纯化,其方法是用Sephadex G100长柱(40~80cm )过柱,洗脱后出现3个峰。第1个峰分子量大,是蛋白变性的聚合的大分子,尚保留部分抗原决定簇,免疫活性弱;第2个峰是纯抗原的蛋白峰,免疫活性好;第3个峰是游离125I或小分子碎片,不具备免疫活性。收集到的第2个纯抗原蛋白峰,免疫活性好;第3个峰是游离125I或小分子碎片,不具备免疫活性。收集到的第2个纯抗原蛋白峰,其性能类似于新鲜标记的抗原。分离纯化的方法解决了标记抗原的贮存、长期使用问题,特别对来之不易的抗原更显得重要。

  2.注意事项

  (1)放射性碘源的选用:无载体的131I或125I均可用于碘化标记,但应尽量选用新鲜的、比放射强度高的、含还原剂量少的放射性碘源。碘源的比放射强度最好≥50~100mCi/ml,至少也要>30mCi/ml,否则加入碘源的容量要增加,随着带入碘源中含有的还原剂(为放射性碘源运输保存所需加入)量也增加,这将会显著降低碘利用率及标记蛋白比放射强度。放置较久和放射性碘源,一方面因衰变致比放射强度降低,另一方面因水的辐射化学产物增多(主要是131I源),都会降低标记时的碘利用率。放射性碘源含还原剂(如Na2S2O5等)量多时,会抵消氯胺T的作用,降低碘利用率,甚至导致标记完全失败。放射性碘源要用无载体的,标记所用全部用具和试剂必须不含碘;只要有极少量的碘的污染,非放射性碘就会稀释放射性碘,使放射性碘利用率显著降低。为了便于放射性防护和除污染,以及减少射线对蛋白质分子的损伤,标记投入的放射碘量不宜过大,一般以<5mCi为宜。

  (2)放射性碘与多肽、蛋白质用量的比例:这比例对标记结果的影响很大。如上述原因,一般标记时放射性投入量不宜过多,示踪实验室中常规每次只用1~2mCi,因而放射性碘与多肽、蛋白质用量的比值主要靠标记时投入的多肽、蛋白质用量来控制。当投入的放射碘量一定时,多肽、蛋白质用量多(即I/多肽、蛋白质比值低),能获得高碘利用率,但所得标记蛋白比放射强度低;相反多肽、蛋白质用量少(即I/多肽、蛋白质比值高),则碘利用率降低,但所得标记多肽、蛋白比放射性随此比值变化都有较大的变动;而当此比值<1后,则碘利用率再下降的幅率较小,标记多肽、蛋白比放射性也不会再增加多少。

  (3)氯胺T与偏重亚硫酸钠的用量及碘化反应时间:氧化碘化标记法中,会导致失活的最主要原因是氧化还原。氯胺T是氧化剂,早期用氯胺T法作碘化标记时氯胺T用量都比较大,或碘化反应时间较长,结果导致蛋白质结构和活性的严重损伤。氯胺T用量大,或长时间进行碘化反应,结果并不能使碘利用率和标记多肽、蛋白质比放射强度提高多少,反而使标记多肽、蛋白活性下降。当用不含还原剂或还原剂很少的放射性碘源时,试以各种蛋白质(包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰岛素等)作微量标记,当氯胺T用量为20μg/0.1ml反应液、0~20C反应20s,碘利用率都已接近或达到最大峰,再加大氯胺T用量和延长反应时间是没有必要的。随放射性碘源中还原剂增多,氯胺T用量也应增加,以达到预期的碘利用率,但决不应目加大氯胺T用量和延长碘化反应时间(通常反应时间不要超过1min),否则会导致标记多肽、蛋白质严重失活,不能用于实验。当然,减少氯胺T用量要在了解放射性碘源还原剂含量的基础上,否则碘源中还原剂量较多,双盲目减少氯胺T用量,就会使标记失败。一般用125I标记时,氯胺T用量要适当加大。加入氯胺T后必须迅速混匀,以防标记不均匀。氯胺T与偏重亚硫酸钠溶液要新配制的。

  氯胺T用量减少了,Na2S2O5用量也就可以随之减少。为保证按时终止碘化反应,实验时加入Na2S2O5一般都是过量的。氯胺T用量大时,加入Na2S2O5的剩余量也就会随之增加,这就可能加重某些对还原剂敏感的蛋白质或多肽生物活性的损伤。为此,Na2S2O5用量也不应过多。只要药品没有变质、试剂是新配的,以重量计算Na2S2O5加入量与氯胺T相同就足以保证终止碘化反应(按反应克分子浓度计算,Na2S2O5/氯胺T重量比约0.4),不要盲目加大用量,并应迅速将标记多肽、蛋白质从反应液中分离出来,以尽量减少多肽、蛋白质活性的损伤。

  某些蛋白质或多肽对氯胺T较敏感,还可进一步减少氯胺T用量、缩短碘化反应时间、降低反应温度,以保护蛋白质的活性。这对一些较容易丧失活性蛋白质或多肽的碘标记十分重要。

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