三、凝集素在免疫细胞化学中的应用
凝集素可为荧光素、酶和生物素等所标记,分别进行下列染色法:
1.直接法 标记物直接标记在凝集素上,使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合。
(1)切片脱蜡至水。
(2)凝集素标记物(100μg/ml),室温,30min。
(3)TBS洗3次,每次2min。
(4)如为荧光素标记物,封片用荧光显微镜观察。如为酶标记物,则应依次进行呈色、脱水、透明和封固后在光学显微下观察。医.学全.在.线www.lindalemus.com
直接法的优点是简便,目前商品用的凝集素药盒已能购得。但灵敏性不够高。
2.间接法 将凝集素直接与切片中的相应糖基结合,而将标记物结合在抗凝集素抗体上。
(1)脱蜡至水。
(2)用含3%的H2O2的甲醇阻断内源性过氧化物酶10min。
(3)凝集素稀释液(100μg/ml)孵育30min。
(4)TBS洗3次,每次2min。
(5)用标记了的抗凝集素抗体(1:100)孵育30min。
(6)TBS洗3次,每次2min。
(7)呈色、脱水、透明、封片。
(8)观察。
间接法染色还可进一步改良为:①三步法:即在凝集素孵育后,接着用抗凝集素抗体孵育,再用标记了的抗-抗凝集素抗体孵育,层层放大,进一步提高其敏感性,PAP复合物也可作为标记物标记在抗-抗凝集素抗体上。②抗生物素—生物素凝集素法:用结合了生物素的凝集素孵育切片后,TBS洗后再以抗生物素—标记物与之结合。间接法较直接法和直接法敏感性高5~10倍或更多一些,但必须购买或自制抗凝集素抗体。
3.糖—凝集素—糖法 本法是利用过量的凝集素与组织切片中特定的糖基相结合。经冲洗后,凝集素上还存在未被占用的结合部位,将这些部位与有过氧化物酶标记的特异性糖基相结合,形成一个三明治样的糖—凝集素—糖的结合物。
(1)脱蜡至水。
(2)用含3%的H2O2的甲醇阻断内源性过氧化物酶10min。
(3)用100μg/ml的凝集素孵育30min。
(4)TBS洗3次,每次3min。
(5)用100μg/mlHRP标记的糖液孵育30min。
(6)TBS洗3次,每次3min。
(7)DAB呈色、脱水、透明、封固。
本法特异性强,灵敏度高,因为这不象生物素—抗生物素法那样要改变凝集素,又不需要像抗体那样要制备抗体。HRP本身含有甘露糖,能与刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素结合。但对其它的凝集素,本法目前普及还有一定困难,因为要将过氧化物酶结合到其它凝集素上,就需要将一个适当的碳水化合物基团嵌入过氧化物酶,称为糖基化(glycosylation),方法虽不复杂(Lee 等1976),但需一定的试剂和设备。商品化能提供的糖基化过氧化物酶品种尚有限。
【注意事项】
①凝集素需要重金属离子维持其活跃的结合部位,如果金属离子耗尽了,就会影响凝集素的结合能力。因此,有作者主张用TBS作为缓冲液,内加微量的金属,配方是:Tris 60.57g,NaCl87g, H2O加至1000ml,其中含CaCl2、MgCl2各1.0mmol/L。或在进入凝集素孵育前,先用该液孵育,以增强凝集素结合力。
②和其它抗体血清应用一样, 应用每批新的凝集素实验时,都先要用缓冲液稀释成不同等级;如8,16,32,64,125,250,500,1000μg/ml,经染色选择最佳稀释度。
③有作者认为阻断组织内源性过氧化物酶所用的H2O2对碳水化合物有影响,可能改变凝集素的结合形式,因此,应尽量少用或不用,我们及一些作者在实验过程中发现影响不明显。
④有作者认为凡经固定的组织切片,不论是石蜡包埋切片或冰冻切片,都有可能使组织中抗原隐蔽,为了暴露隐蔽了的碳水化合物基团,主张在凝集素孵育前用酶处理切片,常用胰蛋白酶液(配制见附表)进行适当的孵育。
⑤已知哺乳动物的质膜含有占蛋白总量的1%~10%的碳水化合物,它们以低聚糖(oligosacchride)糖脂,并主要以糖蛋白的形式存在,糖蛋白线性的或分支的旁链可能含有两个到多个单糖残基,通常有两种或更多的单糖,在单糖单位末端常常是一个带负电荷的N-乙酰神经氨酸的残基,一个唾液酸(siallic acid)。有作者在凝集素实验中常用神经氨酸酶(neuramidinase)分解细胞表面的唾液酸或神经氨酸,以暴露出隐蔽的能与聚集素结合的次终末的碳水化合物。配制方法是将神经氨酸酶(Type V,Sigma Lot 63F—8172 63F--8172)用醋酸缓冲液(含2%牛血清白蛋白)BSA配成0.5μg/ml。
切片脱蜡后进行酶消化的过程中,将该组织切片置于上述配制液中,在湿盒内,37℃孵育30min。用缓冲液洗后,进行凝集素染色。
⑥对照试验,和其它组化染色一样,凝集素染色也需要设对照试验(最好在相邻切片进行)。由于凝集素具有单糖特异性,如果外加相应的糖,把凝集素的结合部位占有了,凝集素就不能再与组织中的糖基相结合了。一般采用的方法是将凝集素预先与相应的糖(0.2mol/L)在室温孵育30min,使之占有凝集素结合部位,再将此液代替凝集素进行孵育,结果应为阴性。在某些情况下即使提高糖液的浓度也不能达到完全的抑制。这时,只有用与凝集素有高亲合力的低聚糖(oligosachrides)代替或将切片预先用相应的糖苷酶孵育去除特异性糖基(Watanalte等,1981)。