胶体金标记蛋白质的原理，一般认为是由于pH值等于或稍偏碱于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大，处于一种微弱的水化状态，较易吸附于金颗粒的表面，由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触，而使胶体金处于稳定状态，如果＝低于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电荷，胶体金带负电荷，二者极易静电结合形成大的聚合物。如果pH高于蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗粒的负电荷相互排斥而不能互相结合。为防止蛋白质与胶体金的聚合与沉淀，常用牛血清白蛋白，卵白蛋白，聚乙二醇或明胶作稳定剂。用Sephacryb S—400 （丙烯葡聚糖S—400)层析分离纯化胶体金蛋白标记物只适用于以BSA作稳定剂者。
一、待标记蛋白质的准备
（1)透析除盐：蛋白质溶液内应除去多余的电解质，不然过高的盐类物质会降低胶体金颗粒的Zeta电位，影响蛋白质的吸附，因此，标记之前必须彻底除盐。一般将蛋白质置入透析袋中然后直接放入双蒸水或极低浓度的盐水（0.005mol/l NaCl , pH7.0)透析。
（2)去除蛋白质中的沉淀：长期低温保存的蛋白质或4℃较长时间保存的抗体，特别是在浓度高于2mg/ml的情况下，很容易形成聚合物，聚合物对标记过程及免疫金探针的稳定性有一定影响，因此，标记之前须离心以除去这些聚合物。一般以100000r/min 4℃离心60min取上清液，调整蛋白质浓度至1mg./ml即可用于标记。
二、胶体金pH值的调整
胶体金与蛋白质的结合成功与否，取决于pH值，一般只有在蛋白质等电点（PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合，因此，标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱。需要提高胶体金的pH值时可用0.1molK2CO3，需要降低胶体金的pH值时可用0.1n HCl。测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头，因此，一般用精密的pH试纸测定其pH即可。
几种常用的蛋白质标记时胶体金所用的pH值见表5-4。
表5-4 常用几种蛋白质标记时胶体金所用的pH值如下
| 蛋白质 | pH |
| 抗体（γ球蛋白) | 9.0 |
| 亲合层析的IgG | 7.6 |
| 单克隆抗体 | 8.2 |
| F（ab＇)2 | 7.2 |
| SPA(葡萄球菌蛋白) | 6.0 |
| 蓖麻子植物凝血素Ⅰ | 8.0 |
| 蓖麻子植物凝血素Ⅱ | 8.0 |
| 花生凝集素 | 6.3 |
| Helix pomatia lectin | 7.4 |
| 大豆凝集素 | 6.1 |
| Lens Culinaris lectin | 6.9 |
| Lotus Tetragonolobus lectin | 6.3 |
| 荆豆凝集素 | 6.3 |
| Bandeirae simplicifolia lectin | 6.2 |
| 过氧化物酶 | 8.0 |
| 类卵粘蛋白 | 4.8 |
| 血浆铜兰蛋白 | 7.0 |
| α-胎球蛋白 | 6.5 |
| 小牛血清白蛋白 | 6.5 |
| 牛血清白蛋白 | 5.5 |
| 牛血球白蛋白结合肽 | 4.5 |
| 牛血清白蛋白结合胰岛素 | 5.3 |
| 霍乱毒素 | 6.9 |
| 破伤风毒素 | 6.9 |
| DNAase | 6.0 |
| RNAase | 9.0 |
| 低密度脂蛋白 | 5.5 |
| α2-巨球蛋白 | 6.0 |
| 抗生物素蛋白（亲合素) | 10.0 |
| 链霉抗生物素蛋白 | 6.6 |
| 麦胚凝集素 | 9.9 |
三、待标记蛋白质最适稳定量的测定
（1)光电比色法：制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液（1ml)，分别加入5ml胶体金中，迅速混匀，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，摇匀，静置5min后测各管。根据胶体金颗粒的大小，OD在520～580nm之间测定，以OD值为纵坐标，蛋白质用量为横坐标作一曲线，取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量。图5.2中10nm的胶体金溶液中蛋白质的最适稳定量为45μg/ml。
图5-2 蛋白最适稳定量示意图
（2)目测法：以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例，将标记的蛋白质逐级稀释后（由5μg～45μg另设对照管)，各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中，5min后，在上述各管内分别加入0.1ml 10%氯化钠，依表5-5顺序进行。医.学.全.在.线www.lindalemus.com
表5-5 具体的做法是按表内进行
| 管数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 胶体金（ml) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 蛋白质（μg) | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 | 0 |
| 10%NaCl(ml) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
①当分别加入0.1ml 10%氯化钠后、混匀静置2h以上观察结果。
②没有加入蛋白质的管为对照管。
③小于5nm颗粒的胶体金溶液，每个管内应加入5μl33%的双氧水，否则有不变蓝色及聚沉现象。未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管，即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则胶体金的红颜色不变。其中含蛋白量最低的试管即含稳定1ml胶体金的必须蛋白量。在此基础上再加上20%即为稳定所需蛋白质的实际用量。
