四、蛋白质的胶体金标记
当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳pH值被确定以后便可进行标记。具体步骤如下：
（1)根据用以标记的胶体金的总量计算出所需要的待标记蛋白质的总量。
（2)在电磁搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中（pH已调至PI超过0.5pH)，加入蛋白质时应逐滴加入，1mg的蛋白质大约5min加完。
（3)在磁性搅拌下加入5%的牛血清白蛋白（BSA)使其终浓度为1%，或加入3%聚乙二醇（PEg MW20000)使其终浓度为0.05%, 我们对比了BSA和PEG稳定胶体金的效果，BSA稳定的标记胶体金，放在4℃达2年半仍然保持良好性能，而用PEG稳定的标记胶体金放在4℃1年左右就有分层现象，而且染色效果显著下降。因此，我们认为最好还是用BSA作稳定剂。
（4)将标记好的胶体金装入透析袋中，两头扎紧，放入蔗糖或硅胶中浓缩，浓缩到原体积的1/10量，浓缩完毕后纯化。离心法纯化时，不要浓缩。
五、胶体金标记蛋白质的纯化
标记好的免疫金探针必须经过纯化处理以后才能用于免疫细胞化学染色。纯化的目的是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。
（一)调整与超速离心法
（1)将标记的大于10nm的胶体金溶液选用15000r/min 4℃离心15min，吸出上清，弃去沉淀，以去除大的聚合物。
（2)一般在10nm以上所标记的胶体金均可在调整离心机上离心，小于10nm颗粒的胶体金用超速离心机离心，在4℃离心1h左右，弃上清，将沉淀以原体积的0.02mol./l TBSpH8.2（内含1%BSA，0.05%叠氮钠)溶解，重复离心2～3次，沉淀溶于原体积的1/10TBS中。4℃保存备用。为了得到颗粒均匀一致的免疫金试剂，上述粗提制剂可用10%～30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度离心，分带收集不同大小颗粒的胶体金标记蛋白制剂。
几种免疫金探针离心所用转速（见表5-6)，离心纯化时所用转速见表5-7，胶体金的OD值见表5-8。
表5-6 几种免疫金探针离心时所用转速参考表
| 胶体金颗粒直径（nm) | 蛋白质 | 时间（min) | 转速（r) |
| 3.0 | GAR IgG | 60 | 30000 |
| 5.0 | GAR IgG | 50 | 25000 |
| 10.0 | RAM IgG | 50 | 19000 |
| 15.0 | SPA | 40 | 17000 |
| 15.0 | ALcc IgG | 40 | 17000 |
| 20.0 | SPA | 40 | 13000 |
| 25.0 | SPA | 35 | 12000 |
说明：GAR IgG=羊抗兔IgG；RAm IgG=兔抗鼠IgG；ALcc IgG=抗肝细胞癌IgG; SPA=葡萄球菌A蛋白
表5-7 几种免疫金探针离心纯化时所用转速
| 胶体金颗粒（nm) | pH | 蛋白质 | 转速（xg) | 时间（min) |
| 5 | 9.0 | 羊抗人IgG | 45000 | 45 |
| 10 | 8.2 | 抗胃癌单克隆抗体 | 45000 | 30 |
| 15 | 6.5 | 链霉亲和素 | 12000 | 45 |
| 20 | 6.0 | SPA | 12000 | 30 |
将纯化好的胶体金用0.02mol/l TBS缓冲液作1：20稀释，用520nm测OD值。
表5-8 不同大小胶体金的OD值
| 胶体金颗粒大小（nm) | OD（520)nm |
| 5 | 2.5 |
| 10 | 2.5 |
| 15 | 3.5 |
| 20 | 5.0 |
