(二)抗体血酸还原法(Stathis and Fabrikanos 1958)
(1)将在4℃预冷的1%HAuCl4水溶液1ml,0.2mol/l K2CO31.5ml、双蒸水25ml混匀。
(2)在搅拌下加入1ml 0.7%抗坏血酸水溶液,立即呈现紫红色。
(3)加双蒸水至100ml,加热至溶液变为透明红色为止。胶体金颗粒直径为8~13nm。
(三)柠檬酸三钠还原法(Frens 1973)
此方法是由Frens在1973年创立的,制备程序很简单,胶体金的颗粒大小较一致,广为采用。该法一般先将0.01%的HAuCl4溶液加热至沸腾,迅速加入一定量1%柠檬酸三钠水溶液,开始有些蓝色,然后浅蓝、蓝色,再加热出现红色,煮沸7~10min出现透明的橙红色。各种颗粒的胶体金制备详见表5-2。
表5-2 柠檬酸三钠用量与胶体金颗粒直径的关系
0.01%的HAuCl4(ml) | 1%柠檬酸三钠(ml) | 直径(ml) |
100 | 5.0 | 10.0 |
100 | 4.0 | 15.0 |
100 | 1.5 | 25.0 |
100 | 1.0 | 50.0 |
100 | 0.75 | 60.0 |
100 | 0.60 | 70.0 |
100 | 0.42 | 98.0 |
100 | 0.32 | 147.0 |
100 | 0.25 | 160 |
按照Frens法还可以制备出其它不同颗粒大小的胶体金出来。许多研究证明用该法制备胶体金时金颗粒的大小是柠檬酸三钠用量的函数,基本的规律是柠檬酸三钠用量多,胶体金颗粒直径小,柠檬酸三钠用量越少,腔体金颗粒直径越大。
(四)鞣酸—柠檬酸三钠还原法(Slot与Gueeze1985年)
该法是以1982年Muhlpfordt法为基础,1985年Slot与Geuze对该法进行了改良,特点是通过改变鞣酸的用量制备出多种颗粒直径的胶体金,而且颗粒的直径均匀一致,很适合于双标及多标研究。制备3nm、5nm、10nm、15nm的胶体金颗粒见表5-3。
表5-3 鞣酸—柠檬酸三钠还原法
A 液 | B 液 | |||||
直径(nm) | 1%柠檬酸钠(ml) | 0.1mol/L K2CO3ml | 1%鞣酸(ml) | H2O(ml) | 1%HAuCl4(ml) | H2O(ml) |
3.3 | 4 | 0.2 | 4 | 11.8 | 1 | 79 |
5 | 4 | 0.2 | 0.7 | 15.1 | 1 | 79 |
10 | 4 | 0.025 | 0.1 | 15.875 | 1 | 79 |
15 | 4 | 0.0025 | 0.01 | 15.987 | 1 | 79 |
操作步骤:
(1)根据所需要的胶体金颗粒分别配制A液和B液。
(2)将配制好的A、B两液在水浴内加热到60℃,并通过控温装置使温度保持稳定。
(3)在电磁搅拌器上搅拌A液迅速加入B液,继续加热直至胶体金变成葡萄酒色,时间大约7~10min。在A、B两液混合后可见溶液立即变成蓝色,大约1~3min就变成红色。
用鞣酸—柠檬酸三钠还原法,柠檬酸三钠主要为还原剂,而鞣酸则有双重作用,一是还原作用,二是保护作用,控制“晶核”的形成过程,也就是说鞣酸的用量多少决定胶体金颗粒的大小形成,因此改变鞣酸的用量就可以改变胶体金的颗粒大小,达到制备不同直径颗粒的胶体金之目的。