（2)二步法：首先用过量的戊二醛与HRP反应（HRP：戊二醛为1：105)，以保证酶分子仅与戊二醛的一个醛基结合，另一个醛基游离；然后用层析法除去多余的戊二醛，制成活性HRP（HRP-戊二醛复合物)，再加入过量的抗体，使活化HRP上剩余的醛基与抗体蛋白分子上的氨基结合，制成酶标抗体。过量的抗体可以保证酶与抗体间均匀连结，避免酶本身聚合。根据所用的HRP与抗体（IgG)比例不同，酶标记率各异，平均为5%～25%。标记步骤如下：
①10～15mg HRP(RZ=3.0),溶解于0.2ml 1.25%戊二醛中（0.1mol/L磷酸缓冲液配制)，18h室温。
②透析或 Sephadex G-25柱层析（0.15mol/l NaCl平衡)，去除过量的戊二醛，收集活化HRP。
③浓缩活化HRP至10mg/ml左右，加入抗体5mg(1.0ml 0.15mol/L NaCl 溶解)。
④碳酸盐缓冲液（pH9.5)调整pH至9.0～9.5,使抗体与活化HRP结合，4℃24h。
⑤加入0.1ml赖氨酸缓冲液，阻断未反应的醛基，4℃，2h。
⑥用半饱和硫酸铵沉淀5次，对PBS透析24h，4℃，换3次PBS，除去硫酸铵（10000rpm/min,30min)。
⑦或用凝胶色谱法（Sephadex G-200/Sephacryl S-200) 等分离标记抗体。
注意：该方法要求HRP的RZ值在3.0左右，游离氨基较少，与戊二醛反应后，制成的酶标抗体大部分为单体；而RZ值小于2.8的HRP，含有较多的游离氨基，与戊二醛反应后，易形成多聚体，使方法的敏感性下降。
2．过碘酸盐氧化法 严格地讲，过碘酸钠（Sudium periodate)不是一种真正的偶联剂，其本身并非作为桥连结在抗体和酶之间，而是借助于过碘酸钠的氧化作用，将酶连结在抗体上。该方法仅适于含糖较丰富的酶（如HRP)的标记。我们知道，HRP分子的糖本身与酶活性无关，利用过碘酸钠氧化这部分糖分子内的-CH基，使之生成-CHO基，再与抗体蛋白的游离氨基反应，生成Shiff’s碱。此Shiff’碱在pH降低时呈可逆性解离，所以经氢硼化钠（NaBH4)还原，形成稳定的酶标抗体复合物（图4-1)。为防止生成的-CHO基与酶蛋白氨基自身交联，预先可用二硝基氟苯（Dintro-fluorobenzene)处理HRP，阻断分子内的ε-、α-氨基。
图4-1 过碘酸盐氧化原理
过碘酸盐氧化法，酶的RZ值≥3时较佳；RZ<3时，糖含量较少，游离氨基较多，氧化时酶易发生本身聚合，影响酶标抗体的产量，据报告，适当地控制过碘酸盐溶液及反应条件，几乎所加入的HRP和抗体均形成酶标抗体，其标记率为70%左右。具体步骤为：医学.全在线www.med126.com
（1)4mg HRP(RZ=3.0)溶于1.0ml双蒸水中。
（2)加0.2ml新鲜配制的0.1mol/LNaIO4，轻轻摇动混合20min,肉眼可见液体内棕黄变成深绿色。
（3)对0.1mol/L醋酸盐缓冲液（pH4.4)透析，20h，4℃。
（4)调整HRP液体的pH至9.5(一般加入20μl0.2mol/L碳酸盐缓冲液pH9.5),立即加入抗体(IgG)8.0mg/Fab 3.0mg (0.01mol/L碳酸盐缓冲液溶解),轻轻混匀后,置室温2h。PH≤8.5时,抗体的NH2基被氧化生成NH3+,后者不能与CHO基反应,所以,保持pH9.0～9.5非常重要。
（5)加入0.1ml新鲜配制的0.4%NaBH4 溶液，置1～4℃2h，以稳定酶标抗体复合物。
（6)经透析等去除未反应的NaBH4 ，避免还原过度。然后经盐析或柱层析等方法分离酶标抗体（方法同戊二醛法)。
如此制得的酶标抗体，加入终浓度1%牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA)分装后于-80℃可保存数年；亦可加入6%等量甘油，混匀置-20℃/4℃保存1年左右。上述两种标记法是ICC研究中最常用的酶标抗体制备方法。
