（2)ALP，是以As-Mx为底物，FB/FR为发色团，生成蓝色/红色不溶性沉淀。ALP标记抗体主要用于内源性过氧化酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。显色液内加入终浓度为2～4mmol/l 的levamisole, 大多数内源性ALP活性可被抑制。通常左旋咪唑（levamisole)以每毫升60～120mmol/L浓度的贮存液-20℃冰箱保存。应用时稀释30倍。为避免反复称取，试剂吸水，As-Mx、FR、FB试剂均应小量分装后-20℃冰箱保存，左旋咪唑能抑制内源性碱性磷酸酶活性。例如：以每次所用显色液30ml计算，分装As-Mx 5～7mg/支、Fr 8mg./支、FB7mg/支，每次使用一支，用前稀释30倍，过滤显色 。FR、FB等在光照射条件下易引起沉淀，故显色反应在暗处进行。
（3)GOD，是以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为β-D-葡萄糖67mg、NBT6.7mg、PMS（Phenazine Methylsulfate)0.167mg,0.05mol/L PB(pH8.3)10.0ml,37℃孵育1h。生成蓝色不溶性沉淀。该终产物不溶于有机溶剂，切片可脱水透明，长期保存。但GOD的敏感度较HRP和ALP为低，电子供体少，应用较局限，主要用于两种酶的放大技术，能提高方法和敏感性和特异性。即用GOD和HRP分别标记第二、第三抗体（例第一抗体为小鼠单克隆抗体、第二抗体为GOD标记的兔抗鼠IgG，第三抗体则为HRP标记的羊抗兔IgG)，ICC染色，以葡萄糖-DAB作显色剂。基本原理如（图4-3)。在这里HRP是作为第二酶系统，利用葡萄糖氧化时生成的H2O2作底物，催化酶促反应，不受内源性过氧化酶的影响。而且GOD和HRP所标记的抗体是结合在同一抗原位置，所以能良好地显示组织抗原的存在。其主要染色步骤为：医学 全在.线提供www.med126.com
①切片经第一抗的孵育；②漂洗，GOD标记的第二抗体孵育40～60min（室温)；③漂洗，HRP标记的第三抗体孵育30～45min（室温)；④漂洗，显色、脱水透明观察同前。
图4-3 两步酶催化反应原理
二、非标记抗体酶法
由于酶标抗体存在一些缺点，例如①酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性；②抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。为此Sternberger等在酶标法的基础上，发展了非标记抗体酶法。包括酶桥法（Enzyme Bridge Method)和过氧化物酶抗过氧化物酶法（Peroxidase Antiperoxidase Method, PAP法)。现分述如下。
（一)酶桥法
1．基本原理 首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体，经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节 省第一抗体的用量。
2．染色步骤 主要程序如图4-4
图4-4 酶桥法主要染色步骤
（1)切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法，第一抗体（假设来自种属A)孵育24h（4℃)。第一抗体的稀释度可高些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合，较牢固，漂洗时不易丢失。
（2)切片与第二抗体（也称桥抗体，抗种属a IgG抗体)孵育1～1.5h（室温)。应用过量的桥抗体能保证一个Fab段与第一抗体结合，另一个Fab段游离。
（3)切片与抗酶抗体（来自种属A)孵育1～1.5h（室温)。因抗酶抗体和第一抗体均系种属a IgG，具有相同的抗原性 ，所以 桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合，起到桥的作用，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上。
（4)切片与酶（HRp 70～100μg/ml,PBS溶解)孵育0.5h（室温)，酶与抗酶抗体结合。
（5)显色等与酶标抗体法相同。
酶桥法克服了酶标抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶活性。但仍有其不足：①在酶抗体血清中，含有低亲合力和高亲合力两类抗体，它们作为抗原与桥抗体结合，主要依赖于桥抗体对它的亲合力，而与其本身对酶的亲合力无关，故二者均可被连结在桥抗体上。低亲合力的抗酶抗体与酶结合较弱，漂洗时易解离，使大部分酶（70%左右)丢失，降低了方法的敏感性。②第三步所用的抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但不能与酶结合，影响组织抗原的显示。为此70年代初，Sternberger(1970)又建立了PAP法，并加以改良，现为ICC研究中常用的方法之一。
（二)PAP法
1．PAP的制备及特征 PAP复合物是离体制备的HRP抗HRP复合物，它的制备方法较多，现简介其中之一。
（1)制备抗HRP血清：健康雄性家兔（2.0kg以上)，可先于足跖皮下注射灭活的卡介苗（共10mg)，2周后重复1次，刺激机体免疫系统功能，1周后于背部脊柱两旁皮内多点注射1.0ml乳剂[（福氏完全佐剂，含HRP3.3mg(RZ=3.0)];间隔2周第2次注射，背部注入含HRP3.3mg的不完全福氏佐剂1.0mg；再间隔2周，第3次注射，2mgHRP（溶于2ml生理盐水中)，分别于前后小腿皮下和背部肌肉内多点注射，1周后采静脉血，检查效价。再隔1周第4次加强注射（条件同第3次)，一周后检查抗体效价，琼脂糖扩散法（HRP0.1mg/ml)为1：128以上时，颈动脉取血，制备血清低温保存备用。
（2)制备PAP复合物：离体条件下，使兔抗HRP抗体与HRP形成可溶性复合物。在制备抗HRP血清时，HRP的纯度要高（RZ≥3)，而制备PAP复合物时，HRP的质量要求不高，甚至可用酶的粗制品。
【步骤】
①取10.50ml抗HRP血清，加7.60ml含7.6mgHRP（1.0mg/ml)的水溶液。
②混匀，室温1h后，离心16000g 4℃15min。
③0.9% NaCl(冷盐水)溶解沉淀，离心16000g 4℃15min，重复4次。
④加15.3ml HRP水溶液（含HRP30.64mg)，室温，持续搅拌。
⑤用1N HCl及0.1N HCl调pH至2.3，沉淀物全部溶解变清，立即用1N 及0.1n NaOH调pH至7.2。
⑥慢慢加等体积的饱和硫酸铵，置0℃45min。
⑦离心35000g 0℃15min，沉淀用50%硫酸铵漂洗两次。
⑧用10.50ml水溶解沉淀，对透析液（48.6g NaCl, 1.5N NaOOCCH3 30ml, 3N(NH4)2SO430ml, 水5.94L)透析，4℃离心，收集上清，加透析液使体积至10.50ml，分装低温保存。
