【质量鉴定】
制备的PAP复合物应检测酶和抗体的含量，以鉴定PAP复合物的质量。常用分光光度计检测PAP的复合物在280nm（IgG的最大吸收波长)和400nm（HRP的最大吸收波长)的光密度值（OD值)，按下式计算IgG和HRP的含量：
一般HRP/抗HRP的克分子比达1.9时，可分装冷藏于-85℃冰箱，据报告如此冷藏的PAP复合物可保留14年之久，活性无改变。但稀释后的PAP复合物不稳定，4℃可保存2～3周。最好临用前配制。
【PAP复合物的特征】
PAP复合物的形成不同于其它抗原抗体反应，在抗原稍过量时，所有的抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物，仅残留少许游离的HRP，而大多数抗原抗体反应需要抗原绝对过量才能形成可溶性复合物。PAP复合物的形状相当稳定，不受抗原量的影响，无论最初加入的抗原抗体过量与否，最终形成的PAP复合物其HRP/抗HRP之比绝大部分为3：2。应用离心沉降、液相扩散等方法分析表明：PAP复合物沉降系数为11.5s,分子量为400～430kD，由此可推算出酶与抗体之比为3：2，即每个PAP生命物由3个HRP分子和2个抗HRP抗体组成，呈五角形结构，3个角为HRP，另两个角为抗HRP抗体。采用H2O2-DAB染色，电镜下已经观察到PAP复合物五角形环状结构，直径平均21nm 。这种结构异常稳定。据报告PAP复合物的抗HRP抗体与HRP结合常数为108，在此可溶性复合物中，即使存在少量游离HRP，亦不影响其稳定性。
2．PAP染色原理及步骤
（1)原理：与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连结在与组织抗原结合的第一抗体上，所不同的是PAP法将酶桥法的步骤3、4合并为1，用PAP复合物代替，即第三步用PAP复合物孵育切片，故称PAP法。PAP复合物中的抗HRP抗体和第一抗体为相同种属动物的IgG，所以桥抗体能够作为“桥”将PAP复合物连结在第一抗体上。医学全在线www.med126.com
（2)染色步骤：主要步骤与酶桥法相似，如图4-5。
①切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法；切片与特异性第一抗体孵育同酶桥法。
②用过量的桥抗体孵育，作用同酶桥法。
图4-5 PAP法主要染色步骤
③用离体制得的PAP复合物（1：30～300稀释)孵育1～1.5h（室温)，使其被桥抗体连结在第一抗体上。亦可用ALP抗ALP复合物代替。
④显色观察等同间接法。
3．PAP法的评价 PAP法应用比较广泛，特别是近几年，PAP、ABC等试剂盒商品化，在科研和临床病理诊断等中有着广阔的前景。其主要特征和注意事项如下：
（1)抗体活性高：非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性，因为在所有的反应过程中，任何抗体均未被酶连结，避免了标记过程（共价键连结)对抗体活性的损害。
（2)灵敏度高：灵敏度是指ICC方法所能发现最少数量抗原而言。从理论上讲，PAP法应该较间接法敏感2倍以上，因为酶标抗体法中，酶与抗体为1：1标记，而PAP复合物含有3个HRP分子。假设一个第一抗体同一个酶标抗体/PAP复合物结合，则被连结于抗原部位的酶分子数量不同，所以PAP法应较敏感。我们知道组织切片抗原的含量是未知的，所以不能直接在切片上检测方法的敏感度；但可以假设相邻切片抗原浓度相对恒定，采用相邻切片染色，以产生特异性染色所用的第一抗体最低浓度作为方法的敏感度，用信噪比（Signal/moise,S/N)表示。据此，Sternberger(1979)认为PAP法较间接法敏感20～25倍，可进一步稀释第一抗体，以节 省其用量。但实际上PAP法与间接法之间的差异并非如此明显。笔者在实验中注意到，PAP显示阳性的抗原，相同的稀释倍数的第一抗体在间接法中亦呈阳性反应，而时间阴性时，PAP法亦为阴性。其原因尚不清楚，可能与桥抗体和第一抗体结合时，“剩余”（游离)的Fab段少，PAP复合物被连结的相应减少有关。另外 ，PAP复合物分子量较大（400KD),冰冻切片时，对组织穿透性远不如酶标抗体（分子量90～180kDa)，所以不适于免疫电镜的标本制作。
