（四)藻红蛋白标记抗体的方法
1．巯基化藻红蛋白（phycoerthrin PE)的制备，600μl的15.5mg/ml盐酸巯醇亚胺（iminothiolane hydrochloride)加到1.2ml的3.6mg/ml的PE中，和1.2ml PB、pH6.8 混合，装入透析袋置入50mmol/l pH6.8 PB中透析，4℃过夜，再换用pH7.5PB透析6h。每个PE分子中可结合8个巯基。
2．PE-IgG制备 异双功能试剂SPDP[n - Succ - inimdyl 3-(2-pyridyldlthio) propinate ] 30μl (1.1mg/ml)的乙醇溶液，加入700μl的4.2mg/ml IgG PB溶液（50mmol/l pH7.5)，在室温中反应2.5h。再加入巯基化Pe 400μl（1.7mg/ml)加到500μl反应混合液中，室温反应12h，加入100μl的50mmol/L碘乙酸钠封闭残余巯基，用PB透析过夜，4℃。加入0.01%Na3N3分装，4℃保存半年。
（五)PE-标记蛋白A方法
（1)取4.08mg PE溶于0.1mol/l pH7.4PB（含0.1mol/l NaCl)1ml中，溶解后，取出0.5ml，再加入10μlSPDP无水甲醇液（2.65mg/ml),SPDP/蛋白摩尔比为10，22℃反应5min，过Sephadex G-50(1×17cm),用100mmol/l pH7.4 PBS（含0.1mol/l NaCl)平衡和洗脱。
（2)0.5ml蛋白（2mg/ml)100mmol/l PB(含有100mmol/l NaCl) pH7.4，加入2.6μl上述SPDP甲醇液，SPDP：蛋白=9.5,22℃,40min ,加入25μmol/L二硫苏糖醇（DTT)pH7.4缓冲液，22℃，25min，同上过Sephadex G-50，收集蛋白A峰。
（3)取0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合，22℃反应6h，混合物4℃保存备用。
以上两种PE标记制品，可最后溶于0.01mol/l pH7.4PB(含有0.1mol/l DETA、1mol/L碘乙酰胺、1%BSA 和0.1%NaN3),0～5℃保存。
（六)蓝色荧光素标记抗体方法
Kbaffan等（1986)首先创立了蓝色荧光素标记和染色技术，可进行双标记或多标记。
（1)取7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methyl coumarin, AMC)260μg溶于二甲亚砜25μl中。
（2)将上液加入10ml IgG的 巴比妥缓冲液（0.5mol/L,pH8.5,内含50～100mg IgG)中，室温反应2h，过Sephadex G-50除去游离荧光素。
AMC呈黄色结晶固体，最大吸收波长354nm,最大荧光波长430nm。
三、荧光抗体质量控制
对制备的荧光抗体必须进行质量鉴定，主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。
（一)染色特异性和敏感性的测定
1．特异性染色效价的测定 直接染色以倍比稀释荧光抗体溶液如1：2，1：4，1：8……，与相应抗原标本作一系列染色，荧光强度在“+++”的最大释释度，即为该荧光抗体的染色滴度（效价)或单位。实际染色应用时，可取低一个或两个稀释度（即2～4个单位)，如染色效价为1：64，实际应用时可取1：32或1：16。间接染色效价可按抗核抗体荧光染色法步骤，先用不同稀释度的荧光抗体染色，结果以抗核抗体荧光强度“++”为标准，染色用效价和直接法相同。
2．非特异性染色测定 根据荧光抗体的用途不同，可用相类似的抗原切片或涂片，倍比稀释荧光抗体，按常规染色，结果在标本上出现的非特异染色应显著低于特异染色滴度，否则应采取消除非特异性染色的方法处理荧光抗体。
3．吸收试验 在荧光抗体中加入过量相应抗原，于室温中搅拌2h后，移入4℃中过夜，3000r/min,离心30min，收集上清液，再用以染相应抗原阳性标本，结果应不出现明显阳性荧光。
4．抑制试验如前述。
（二)F/P比值的测定
F（荧光素)和P（抗体蛋白)的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量，一般要求F/P的克分子比值为1～2。过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，降低敏感性。
1．蛋白质定量 测定荧光抗体的蛋白质mg/ml量。
2．结合荧光素定量 先制作荧光素定量标准曲线，即准确称取FITC1mg,溶于10ml 0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液中，再用0.01mol/l pH7.2PBS稀释到100ml，此时荧光素含量为10 μg/ml，以此为原液，再倍比稀释9个不同浓度的溶液，用分光光度计在490nm波长测定光密度值（OD)，以光密度为纵坐标，荧光素含量为横坐标，作标准函数图。医学 全在.线提供www.med126.com
荧光素与蛋白质结合后，其吸收光谱峰值向长波方向位移约5nm,FITC和蛋白质结合后由490nm变为493～495nm，RB200和蛋白质结合后变为595nm。
F/P比值的计算：可按以下公式计算。
式中160000为抗体蛋白质的分子量，390为FITC的分子量。蛋白质从克换算为毫克需再乘以103，而荧光素从克换算为微克需要再乘以106。
测定RB200荧光抗体的克分子比值公式如下：
按图3-4测定法更为简便，即先用276nm波长测得蛋白质的OD值，再用493波长测得FITC的OD值，将这两个OD值在图3-14上连成一直线，直线与各纵线交叉处，即可查出标记抗体的以下数值：FITc μg/ml ，F/P 的μg/mg,F/P的克分子比值，蛋白mg/ml等。
图3-14 FITC标记物中球蛋白、荧光色素和E/P比值计算图
四、荧光抗体的保存
以0～4℃或-20℃低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性。最好加入浓度为1：5000～10000的硫柳汞或1：1000～5000的叠氮钠防腐，小量分装如0.1～1ml，真空干燥后更易长期保存。
