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您现在的位置: 医学全在线 > 理论教学 > 基础学科 > 免疫细胞与核酸分子杂交 > 正文:常用缓冲液
    

常用缓冲液

  1.分子克隆常用缓冲液

  2.磷酸缓冲液

  (1)25℃下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制

pH

1mol/L K2HPO4(ml)

1mol/L KH2PO4(ml)

5.8

8.5

91.5

6.0

13.2

86.8

6.2

19.2

80.8

6.4

27.8

72.2

6.6

38.1

61.9

6.8

49.7

50.3

7.0

61.5

38.5

7.2

71.7

28.3

7.4

80.2

19.8

7.6

86.6

13.4

7.8

90.8

9.2

8.0

94.0

6.2

  (2)25℃下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制

pH

1mol/L Na2HPO4(ml)

1mol/L NaH2PO4(ml)

5.8

7.9

92.1

6.0

12.0

88.0

6.2

17.8

82.2

6.4

25.5

74.5

6.6

35.2

64.8

6.8

46.3

53.7

7.0

57.7

42.3

7.2

68.4

31.6

7.4

77.4

22.6

7.6

84.5

15.5

7.8

89.6

10.4

8.0

93.2

6.8

  ※:用蒸馏水将混合的两种1mol/L贮存液稀释至1000ml,根据Henderson-Hasselbalch方程计算其pH值:

  pH=pK’+1g([质子受体]/[质子供体])

  在此,pK’=6.86(25℃)。

  3.电泳缓冲液

  测序凝胶加样缓冲液

  98%去离子甲酰胺

  10mol/L EDTA(pH8.0)

  0.025%二甲苯青FF

  0.025%溴酚蓝

  甲酰胺:许多批号的试剂级甲酰胺,其纯度符合使用要求,无须再进行处理。不过,一旦略呈黄色,则应用在磁力搅拌器上将甲酰胺与Dowex XG8混合床树脂共同搅拌1小时进行去离子处理,并用Whatman 1号滤纸过滤2次,去离子甲酰胺分装成小份,充氮存于-70℃。

常用的电泳缓冲液

缓冲液

使用液

浓贮存液(每升)

Tris-乙酸(TAE) 1×:0.04mol/L Tris-乙酸 50×:242g Tris碱
  0.001mol/L EDTA 57.1ml冰乙酸
    100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
Tris-磷酸(TPE) 1×:0.09mol/L Tris-磷酸 10×:10g Tris碱
  0.002mol/L EDTA 15.5ml85%磷酸(1.679g/ml)
    40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
Tris-硼酸(TBE)a 0.5×0.045mol/L Tris-硼酸 5×:54g Tris碱
  0.001mol/L EDTA 27.5硼酸
    20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
碱性缓冲液b 1×:50mmol/L NaOH 1×:5ml 10mol/L NaOH
  1mmol/L EDTA 2ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)
Tris-甘氨酸c 1×:25mmol/L Tris 5×:15.1g Tris
  250mmol/L 甘氨酸 94g 苷氨酸(电泳级)(pH8.3)
  0.1% SDS 50ml 10% SDS(电泳级)

  说明:

  ①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物,为避免这一问题,可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液,出现沉淀后则予以废弃。

  以片都以1×TBE作为使用液(即1:5稀释浓贮液)进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1:10稀释的贮存液作为使用液。

  进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小, 故通过缓冲液的电流量通常较大,需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。

  ②碱性电泳缓冲液应现用现配。

  ③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

  2×SDS凝胶加样缓冲液:

  100mmol/L Tris·HCl(6.8)

  200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)

  4%SDS(电泳级)

  0.2%溴酚蓝

  20%甘油

  不含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液可保存于室温,应在临用前取1mol/L贮存液现加于上述缓冲液中。

  4.凝胶加样缓冲液

缓冲液类型

6×缓冲液

贮存温度


0.25%溴酚蓝


4℃

0.25%二甲苯青FF
40%(W/V)蔗糖水溶液


0.25溴酚蓝


室温

0.25%二甲苯青FF
15%聚蔗糖(Ficoll400)


0.25%溴酚蓝


4℃

0.25%二甲苯青FF
30%甘油水溶液


0.25%溴酚蓝


4℃

40%(W/V)蔗糖水溶液
  碱性加样缓冲液:  
300mmol/L NaOH
6mmol/L EDTA


18%聚蔗糖(Ficoll400)


4℃

0.15%溴甲酚绿
0.25%二甲苯青FF

  使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三:增大样品密度;以确保DNA均匀进入样品孔内;使样品呈现颜色,从而使加样操作更为便利,含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍,而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时,溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同,而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%~1.4%的范围内,这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。

  选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是,对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料,因为在碱性pH条件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。

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