二、缓冲液
免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多，即使是同种缓冲液，其浓度、pH、离子强度等也常常不同。在此介绍几种最常用的缓冲液的配制。
1．0.2mol/L(pH7.4)磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer, PB)
试剂： NaH2PO4·2H2O
Na2HPO4·12H2O
配制方法：配制时，常先配制0.2mol/L的 NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（PB)，根据需要可配制不同浓度的PB和PBS。
（1)0.2mol/L的 Na2HPO4；称取Na2HPO4.12H2o 31.2g(或 NaH2PO4·H2O 27.6g)加重蒸水至1000ml溶解。
（2)0.2mol/L的 Na2HPO4：称取NaHPO4.·12H2o 71.632g（或 Na2HPO4·7H2O 53.6g或 Na2HPO4·2H2o 35.6g)加重蒸水至1000ml溶解。
（3)0.2mol/L pH7.4的PB的配制：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4和81ml 0.2mol/L的 Na2HPO4·12H2O,充分混合即为0.2mol/L的PB（pH约为7.4～7.5)。若pH偏高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温保存即可。
2．0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水（Phosphate Buffered Saline, PBS)
试剂：0.2mol/L PB 50ml
NaCl 8.5～9g(约0.15mol/L)
重蒸水 至1000ml
配制方法：称取NaCl 8.5～9g及0.2mol/L的PB 50ml，加入1000ml的容量瓶中，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀即可。若拟配制0.02mol/L的PBS，则PB量加倍即可，依此类推。
PB和PBS是免疫细胞化学实验中最为常用的缓冲液，0.01mol/L的PBS主要用于漂洗组织标本、稀释血清等，其pH应在7.25～7.35之间，否则需要调整。0.1mol/L的PB常用于配制固定液、蔗糖等。一般情况下，0.2mol/l PB的pH值稍高些，稀释成0.01mol/L的PBS时，常可达到要求的pH值，若需调整pH，通常也是调PB的pH。
3．Karasson –Schwlt’s磷酸盐缓冲液
试剂： NaH2PO4·H2O 3.31g
Na2HPO4·7H2O 33.77g
重蒸水 至1000ml
配制方法：同前
该缓冲液主要用于配制Zamboni’s固定液。
4．0.5mol/L pH7.6的Tris- HCl缓冲液。
试剂：Tris(三羟甲基氨基甲烷) 60.57g
1N HCl 约420ml
重蒸水 至1000ml
配制方法：先以少量重蒸水（300～500ml)溶解Tris,加入HCl后，用1N的HCl或1N的NaOH将pH调至7.6，最后加重蒸水至1000ml。此液为储备液，于4℃冰箱中保存。免疫细胞化学中常用的Tris-HCl缓冲液浓度为0.05mol/L，用时取储备液稀释10倍即可。
该液主要用于配制Tris缓冲生理盐水（TBS)、DAB显色液。
5．Tris缓冲生理盐水（Tris Buffered,Saline,TBS)
试剂：0.5mol/L Tris-HCl缓冲液 100ml
NaCl 3.5～9g(0.15mol/L)
重蒸水 至1000ml
配制：先以重蒸水少许溶解NaCl,再加Tris-HCl缓冲液，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀使Tris终浓度为0.05mol/L。
TBS主要用于漂洗标本，常用于免疫酶技术中。
6．Tris-TBS(PBS)
试剂：Triton X-100 10ml(1%)或3ml(0.3%)
0.5mol/L Tris缓冲液（pH7.6) 1000ml(50ml)或(0.2mol/L的PB)
NaCl 8.5～9g
重蒸水 至1000ml
配制方法：先以重蒸水少许溶解NaCl后，加入Triton X-100及Tris缓冲液或（PB)，最后加重蒸水至1000ml，充分摇匀。
该液常用浓度为1%及0.3%，前者主要用于漂洗标本，后者主要用于稀释血清。
7．0.1mol/L（pH7.4)二甲胂酸缓冲液
试剂：0.2mol/L二甲胂酸钠 500ml
0.1N HCl 28ml
蒸馏水 至1000ml
配制方法：先称取二甲胂酸钠（MW：214)42.8g,加蒸馏水至1000ml，使0.2mol/L的二甲胂酸钠溶液；再取HCl 1.7ml加蒸馏水至1000ml ,配成0.1N，最后 取0.2mol/L二甲胂酸钠溶液500ml及0.1n HCl 28ml混合，加蒸馏水至1000ml，即为0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液。
8．几种常用的不同pH值缓冲液的配制表
（1)0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.7～8.0)
|
pH |
0.2mol/L NaH2PO4(ml) |
0.2mol/L Na2HPO4(ml) |
|
5.7 |
93.5 |
6.5 |
|
5.8 |
92.0 |
8.0 |
|
5.9 |
90.0 |
10.0 |
|
6.0 |
87.7 |
12.3 |
|
6.1 |
85.0 |
15.0 |
|
6.2 |
81.5 |
18.5 |
|
6.3 |
77.5 |
22.5 |
|
6.4 |
73.5 |
26.5 |
|
6.5 |
68.5 |
31.5 |
|
6.6 |
62.5 |
37.5 |
|
6.7 |
56.5 |
43.5 |
|
6.8 |
51.0 |
49.0 |
|
6.9 |
45.0 |
55.0 |
|
7.0 |
39.0 |
61.0 |
|
7.1 |
33.0 |
67.0 |
|
7.2 |
28.0 |
72.0 |
|
7.3 |
23.0 |
67.0 |
|
7.4 |
19.0 |
81.0 |
|
7.5 |
16.0 |
84.0 |
|
7.6 |
13.0 |
87.0 |
|
7.7 |
10.5 |
89.5 |
|
7.8 |
8.5 |
91.5 |
|
7.9 |
7.0 |
93.0 |
|
8.0 |
5.3 |
94.7 |
(2)0.05mol/L Tris-HCl缓冲液（pH7.19～9.10)
|
pH |
0.2mol/L Tris(ml) |
0.2mol/L HCl(ml) |
H2O |
|
7.19 |
10.0 |
18.0 |
12.0 |
|
7.36 |
10.0 |
17.0 |
13.0 |
|
7.54 |
10.0 |
16.0 |
14.0 |
|
7.66 |
10.0 |
14.0 |
15.0 |
|
7.77 |
10.0 |
14.0 |
16.0 |
|
7.87 |
10.0 |
13.0 |
17.0 |
|
7.96 |
10.0 |
12.0 |
18.0 |
|
8.05 |
10.0 |
11.0 |
19.0 |
|
8.14 |
10.0 |
10.0 |
20.0 |
|
8.23 |
10.0 |
9.0 |
21.0 |
|
8.32 |
10.0 |
8.0 |
22.0 |
|
8.41 |
10.0 |
7.0 |
23.0 |
|
8.51 |
10.0 |
6.0 |
24.0 |
|
8.62 |
10.0 |
5.0 |
25.0 |
|
8.74 |
10.0 |
4.0 |
26.0 |
|
8.92 |
10.0 |
3.0 |
27.0 |
|
9.10 |
10.0 |
2.0 |
28.0 |
(3)0.2mol/L醋酸盐缓冲液（pH3.6～5.6)
|
pH |
0.2mol/L醋酸（ml) |
0.2mol/L醋酸钠（ml) |
|
3.6 |
46.3 |
3.7 |
|
3.8 |
44.0 |
6.0 |
|
4.0 |
41.0 |
9.0 |
|
4.2 |
36.8 |
13.2 |
|
4.4 |
30.5 |
19.5 |
|
4.6 |
25.5 |
24.5 |
|
4.8 |
20.0 |
30.0 |
|
5.0 |
14.8 |
35.2 |
|
5.2 |
10.5 |
39.5 |
|
5.4 |
8.8 |
41.2 |
|
5.6 |
4.8 |
45.2 |
(4)0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH5.0～7.4)
|
pH |
0.2mol/L二甲胂酸钠（ml) |
0.2N HCl(ml) |
蒸馏水 |
|
5.0 |
25 |
23.5 |
51.5 |
|
5.2 |
25 |
22.5 |
52.5 |
|
5.4 |
25 |
21.5 |
53.5 |
|
5.6 |
25 |
19.6 |
55.5 |
|
5.8 |
25 |
17.4 |
57.5 |
|
6.0 |
25 |
14.8 |
60.3 |
|
6.2 |
25 |
11.9 |
63.1 |
|
6.4 |
25 |
9.2 |
65.8 |
|
6.6 |
25 |
6.7 |
68.3 |
|
6.8 |
25 |
4.7 |
70.3 |
|
7.0 |
25 |
3.2 |
71.8 |
|
7.2 |
25 |
2.1 |
72.9 |
|
7.4 |
25 |
1.4 |
73.6 |
注：HCI可由NCO3代替，配制成二甲胂酸钠-HNO3缓冲液。
（5)0.2mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.2～10.7)
|
pH |
0.2mol/L Na2CO3(ml) |
0.2mol/L NaHCO3(ml) |
|
9.2 |
4.0 |
46.0 |
|
9.3 |
7.5 |
42.5 |
|
9.4 |
9.5 |
40.5 |
|
9.5 |
13.0 |
37.0 |
|
9.6 |
16.0 |
34.0 |
|
9.7 |
19.5 |
30.5 |
|
9.8 |
22.0 |
28.0 |
|
9.9 |
25.0 |
25.0 |
|
10.0 |
27.5 |
22.5 |
|
10.1 |
30.0 |
20.0 |
|
10.2 |
33.0 |
17.0 |
|
10.3 |
35.5 |
14.5 |
|
10.4 |
38.5 |
11.5 |
|
10.5 |
40.5 |
9.5 |
|
10.6 |
42.5 |
7.5 |
|
10.7 |
45.0 |
5.0 |
