三、显色液
免疫细胞化学中，由于抗原-抗体反应所形成的复合物本身无色，无法直接观察，因而需借助于某些化学基团的呈色作用，使其得以显示，以利于在显微镜下观察。常用的显色液有：
1．DAB（Diaminobenzidine)显色液
DAB即3，3-二氨基苯联胺
试剂：DAB（常用四盐酸盐) 50mg
0.05mol/L TB 100ml
30% H2O2 30～40μl
配制方法：先以少量0.05mol/L(pH7.6)的TB溶解DAB，然后加入余量TB，充分摇匀，使DAB终浓度为0.05%,过滤后显色前加入30%的H2O230～40μl，使其终浓度为0.01%。
DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法（如酶标法、PAP法等)，其终产物可直接在光镜下观察，也可经OsO4处理后，增加反应产物的电子密度，用于电镜观察。但有几点需注意：DAB溶解要完全，否则未溶解的颗粒沉积于标本上影响观察；DAB浓度不易过高，否则显色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，故操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24h后使用。
2．4-氯-1-萘酚（4-Cl-1-Naphthol)显色液
配方1：4-Cl-1-萘酚 100mg
纯乙醇 10ml
0.05mol/L TB(pH7.6) 190ml
30% H2O2 10μl(0.003%)
配制方法：先将4-Cl-1-萘酚溶解于乙醇中，然后加入Tb 19ml，用前加入30% H2O2使其终浓度为0.005%，切片显色时间通常为5～20min。
配方2：4-Cl-1-萘酚
N-二甲基甲酰胺（DMF)
0.05mol/L TB(pH7.6)
30% H2O2
配制方法：先将4-Cl-1-萘酚加入DMF中，加热溶解使呈乳白色，再加入TB，乳白色变为絮状，在7.5℃加热5min后加入H2O2，搅动使絮状消失，趁热过滤，当降至略低于50℃时才放入组织标本（注意：温度过高易损伤标本，过低则易重新出现沉淀)。显色时间通常为5min左右。
4-Cl-1-萘酚的终产物显示蓝色。
多数认为最好去除白色沉淀（如上述)，但Larsson等认为，白色沉淀可作为背景，使阳性部位更易观察。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚显色的组织标本，勿用酒精脱水。
3．3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole,AEC)显色液
试剂：AEC 20mg
二甲基甲酰胺（DMF) 2.5ml
0.05mol/L醋酸缓冲液（pH5.5) 50ml
30%H2O2 25ml
配制方法：先将AEC溶于DMF中，再加入醋酸缓冲液充分混匀。临显色前，加入30%H2O2。切片显色时间为5～20min。
该显色液作用后，阳性部分呈深红色，加以苏木精或亮绿等作为背景染色，则效果更佳。由于终产物溶于酒精和水，故需用甘油封固。
4．TMB显色液
试剂：TMB
HCl
亚硝基铁氰化钾
无水酒精
配制方法：
（1)醋酸盐缓冲液：取1.0mol/L的HCl 190ml加入1.0mol/L的醋酸钠400ml中混合，再加蒸馏水稀释至1000ml，用醋酸或NaOH将pH调至3.3。
（2)A液：取上述缓冲液5ml，溶解100mg亚硝基铁氰化钾，加蒸馏水92.5ml混合。
（3)B液：称取5mg TMB加入2.5ml无水酒精中，可加热至37℃～40℃直到TMB完全溶解。
（4)孵育液：放入标本前数秒，取2.5ml B液及97.5ml A溶于试管中充分混合。（液体在20min内应保持清亮的黄绿色，否则可能已有污染)。酶反应时，加入终浓度为0.005%的H2O2。
（5)主要显色步骤：组织标本在蒸馏水（或PBS)中漂洗数次（每次约10～15min)后放入未加H2O2的孵育液中作用20min（19℃～30℃)，然后向孵育液中放入H2O2（每100ml孵育液中加0.3%的H2O2 1.0～5.0ml)继续孵育液20min左右（19℃～23℃)，捞出标本漂洗数次（共30min左右)。在0～4℃条件下可在漂洗液放置4h直至贴片、脱水，封片。也可在贴片前在1%的中性红中负染2～3min，也可在1%派诺宁（pH3.3～3.5)中负染5min后贴片、脱水、封片。医学全在线www.med126.com
TMB即四甲基联苯胺（Tetrabenzidine)是一种脂溶性较强的基团，因此容易进入细胞与细胞器中的HRP反应，且由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深兰色沉淀物，这使得TMB成为组化实验中的一种很好的发色团。同时反应产物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反应进行。TMB的反应产物为深蓝色，利于光镜观察，且反应产物越聚越大，常超出单个细胞器的范围（而DAB则被限制在其内)，故TMB反应的检测阈较低。由于上述优点，目前TMB常用于光镜及超微结构水平的HRP及HRP-WGA神经投射的研究。需要注意的是：TMB显色液中的A液和B液应在2h内新鲜配制。另外，TMB是一种较强的皮肤刺激剂，并有致癌的潜在可能，故使用时应带手套及在通风条件下操作。
5．NBT显色液
试剂A液：5%NBT：称 取0.5gNBT溶于10ml 70%的DMF（二甲基甲胺)内，充分混合，常存于4℃，也可装成小份，-20℃保存，用前复温。
B液：5% BCIP：称取BCIp 0.5g溶于10ml 100%的DMF内，混匀。4℃或分装存于-20℃，用前恢复至室温。
C．显色液：取A液40μl，加入到盛有10ml的0.1mol/l Tris-HCl(pH9.5,钤0.1mol/L NaCl、5mmol/L MgCl2)管内，充分混匀；再加入B液40μl，轻轻混合即可。最好用前新鲜配制。
NBT即四唑氮蓝（Nitro-Blue-Tetrazolium),MW=818,为深蓝色无定形微溶物质。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)。当二者存在时，在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP)作用下，NBT被还原形成显微镜下可见的蓝色或紫色沉淀。
