免疫细胞化学技术常用试剂介绍

　　六、酶消化液

　　1．0.1%胰蛋白酶

　　试剂：胰蛋白酶 　　　　　0.1gm

　　0.1%氯化钙（pH7.8)　　　100ml

　　配制方法：先配制0.1%的CaCl2,用0.1mol/L的NaOH将其pH调至7.8，然后加入蛋白酶溶解之。用前将胰蛋白酶消化液在水浴中予热至37℃（载有标本的玻片也在TBS中予热至同样样温度)。该消化液时间约为5～30min。

　　2．0.4%胃蛋白酶

　　试剂：胃蛋白酶 　　　　　400mg

　　0.1N HCl　　　　　　　　 100ml

　　配制方法：同胰蛋白酶。消化时间在37℃约为30min。

　　3．0.06% Pronase

　　试剂：Pronase　　　　　　　0.06g

　　0.05mol/L TB(pH7.5)　　 　100ml

　　配制方法：同前。

　　在免疫细胞化学染色中，有时经Formalin过度固定的标本，常会产生过量的醛基，遮盖抗原，影响一抗与抗原的结合。用蛋白酶溶液消化，可起到暴露抗原部分的作用。消化时间应根据不同组织而异，总之，在保持组织形态不被破坏的前提下，宜尽量延长消化时间。以上三种酶消化液中，以第一种最为常用。

　　七、其它

　　1．蔗糖溶液　　免疫细胞化学中应用的蔗精，常用浓度为5%～30%。一般光镜研究，仅用20%蔗糖处理已足矣，若制备电镜标本，在冰冻前最好经上行蔗糖（5%、10%、15%、20%及20%蔗糖-5%甘油等)处理，以确保其良好的细微结构。

　　（1)20%蔗糖液：

　　试剂：蔗糖 　　　　　　　　　　20g

　　0.1mol/L PB(pH7.5)　　　　 　　至100ml

　　配制方法：先以少许0.1mol/L的PB溶解蔗糖，再加0.1mol/l PB至100ml充分混合，置4℃冰箱保存。

　　该液多用于纯光镜研究。标本在刚放入浓度如此高的蔗糖液，常浮在上面，当标本沉到底部时即可。通常光镜标本浸泡在20%蔗糖液中过夜。都能达到要求。

　　（2)20%蔗糖-5%甘油：

　　试剂：蔗糖　　　　　　 20g

　　甘油 　　　　　　　　　5ml

　　0.1mol/L PB　　　　　　至100ml(约95ml)

　　配制方法：先用少许PB溶解蔗糖后，再加入甘油，充分混匀，最后补足PB至100ml，于4℃保存备用。

　　该液主要用于电镜标本的处理，常浸泡过夜（其它浓度的蔗糖中常分别为2h左右)。

　　蔗糖是一种廉价的防冻剂，兼有脱水的作用，它可减小标本在冰冻切片时冰晶形成的数量和大小，应用较为方便。若无试剂蔗糖（Sucrose)也可用普通蔗糖（Cane Sugar)。配制好的蔗糖溶液，放置时间超过一个月时，应重新配制。

　　2．T riton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)　　免疫细胞化学中，Triton X-100常用浓度为1%和0.3%，但通常是先配制成30%的Triton X-100储备液，临用时稀释至所需浓度。

　　30% Triton X-100的配制：

　　试剂：Triton X-100　　　　　　　　　　　　　　　　　28.2ml

　　0.1mol/L PBS(pH7.3)或0.05mol/l TBS(pH7.4)　　　　　　72.8ml

　　配制方法：取Triton X-100及PBS（或TBS)混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀。用前取该储备液稀释至所需浓度。

　　Triton X-100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂)，分子量为646.86（C34H62O11)。它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。1%的Triton X-100常用于漂洗组织标本，0.3%的Triton X-100则常用于稀释血清，配制BSA等。

　　3．甲醇-H2O2液

　　试剂：纯甲醇 　　　10ml

　　30% H2O2　　　　　 0.1ml

　　配制方法：吸取30%的H2O20.1ml，加入100ml纯甲醇中，充分混匀即可，使H2O2终浓度为0.3%（也有的用0.03%、0.5%等)。

　　甲醇-H2O2处理组织标本，具有封闭内源性过氧化物酶活性的作用，但其具体机制至今仍不详。通常处理时间在室温约为5～30min。注意，用H2O2处理标本，对某些抗原的抗原性有影响，故建议在使用新的抗血清或抗原时，最好同时设立非处理对照组。

　　4．常用生理盐液

常用生理盐液的成分（g/1000ml)

　　配制方法：精确称取各种药品（如上表)，加入500ml重蒸水中，待完全溶解后，补足重蒸水至1000ml，充分混匀即可。

　　在免疫细胞化学实验中，某些物质不宜经固定剂作用或经固定剂作用后仍易丢失，而需浸泡在生理盐液中。这些生理盐液的成分与正常哺乳动物血清的成分相似，能使组织离体后能处于尽量接近生理状态时的环境。Glucose通常是在用前临时加入。有的（如Kerbs液)在使用时通常需通入含CO2/O2为2.5～5%/97.5～95%的气体。这些生理盐液中的CO2和二碳酸盐，主要起缓冲作用，Glucose主要是提供离体组织有限的代谢所需的能量。

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