分子克隆载体

　　（三)猴病毒40（SV40)

　　猴病毒40（SV40)的基因组常用来作为克隆载体，把外源DNA转入哺乳类细胞。猴病毒40是球形动物病毒，直径40nm，呈20面体，有一个共价闭环的双链DNA基因组，全长5244bp。它在猴肾中增殖。被SV40感染的细胞都会出现SV40的T抗原。早已证明完整的小鼠染色体β珠蛋白基因（包括所有的间插顺序和两侧顺序)整合在SV40中后，在被感染的猴肾细胞中都能正确地转录和翻译。表明猴肾细胞的拼接系统能有效地处理小鼠β珠蛋白的初级转录本。

　　可是，SV40作为克隆载体有其局限性：①SV40基因组的晚期功能区的裂解性，不利于外源DNA的重组和表达；②早期功能区与病毒的致癌性有关，使用时有顾虑；③重组DNA片段的大小受体限制。

　　（四)逆转录病毒

　　逆转录病毒是RNA病毒，它有三个基因：gag-编码病毒的核心蛋白；pol-编码逆转录酶；env-编码病毒的被膜糖蛋白。有的逆转录病毒还带有癌基因（vonc)，即有的逆转录病毒有致癌作用。近年来，已设计构建成一些缺陷型病毒（defective virus)使逆转录病毒成为有用的基因载体，成功地把抗药性基因转入了人体造血前体细胞，并在细胞中表达。Hock等选用了缺失编码病毒外壳蛋白基因的逆转录病毒，因此不能合成自身的外壳，但它有识别外壳蛋白进行包装的信号（一段尚未鉴定的DNA顺序)。用这种缺陷的逆转录病毒去感染某种细胞株，这种细胞株包含有辅助病毒（helper virus)。辅助病毒能合成蛋白外壳，但缺失了识别蛋白外壳进行包装的信号，因此它不能包装成病毒颗粒。当用逆转录病毒感染细胞株后，逆转录病毒的RNA进入辅助病毒的外壳蛋白，成为病毒颗粒。这时把受感染的细胞同骨髓细胞一起培养，包装在辅助病毒外壳蛋白中的逆转录病毒RNA，进入骨髓细胞，病毒DNA插入宿主细胞基因组，基因的活性得到表达。这时，由于骨髓细胞里面没有辅助病毒，所以整合进宿主基因组的逆转录病毒，不再有外壳蛋白可供包装，因此也就无法增殖，而只能被“陷”在宿主基因组中，通过细胞分裂而传给下一代子细胞。

　　三、柯斯质粒

　　1978年Collins和Hohn构建一种新型的大肠杆菌克隆载体，命名为cosmid（柯斯质粒)。它是用正常的质粒同噬菌体λ的cos位点构成。例如，柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体λ的cos位点的一段DNA构成（图23-5)，全长43.kb。在包装时，cos位点打开而产生噬菌体λ的粘性末端。由于pHC79有pBR322DNA，所以也就有氨苄青霉素抗性和四环素抗性两个标记。图23-5说明了克隆基因时有用的限制酶切点。所以可以说柯斯质粒是一类特殊的重组质粒。

图23-5　柯斯质粒pHC₇₉

　　设计构建的柯斯质粒一般长4～6kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体λ一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。如把宿主菌在含氯霉素的培养基中生长，柯斯质粒可以扩增到宿主细胞DNA总量的50%左右。

　　采用柯斯质粒作载体的困难是：①载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出30～45kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二处片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。

　　现将上面提到的四种载体作一比较（表23-3)

表23-3 四种载体的比较

　　* 外源DNA如超过10kb，则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低

　　** 已有个别质料可用于此目的　　

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