（二)四种脱氧三磷酸核苷酸（4×dNTPs)
在PCR反体系中dNTP终浓度高于50mmol/L会抑制Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。PCR常用的浓度为50～200μmol/L，不能低于10～15μmol/L。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。
决定最低dNTP浓度的因素是靶序列DNA的长度和组成，例如，在100μl反应体系中，4×dNTPs浓度若用20μmol/L，基本满足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列。50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μg DNA,而200μmol/L足以合成25μg/DNA。
购自厂商的dNTP溶液一般均未调pH，应用1mol/l NaOH将dNTP贮存液pH调至7.0，以保证反应的pH值不低于7.1。市购的游离核苷酸冻干粉，溶解后要用NaOH中和，再用紫外分光光度计定量。医学.全在线www.med126.com
（三)引物的量
引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～1μmol/L之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。
（四)Taq DNA聚合酶的量
典型PCR反应混合物中，所用酶浓度为2.5U/μl，常用范围为1～4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，多聚酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。
由于生产厂家所用兵配方、制造条件以及活性定义不同，不同厂商供应的Taq DNA聚合酶性能也有所不同。
Cetus公司酶定义是：1个酶单位是指在以下分析条件下，于74℃，30min内使10nmmol的dNTP掺入酸不溶性成分所需的酶。测定时间为10min，折算成30min掺入量。
分析条件为25nmol/L TAPS（三羟基-甲基-氨基丙烷磺酸钠pH9.3,25℃),50mmol/l KCl, 2mmol/L MgCl2,1mmol/L β-ME（巯基乙醇)，dATP、dTTP、dGTP各200mmol/L，dCTP为100mmol/L(由不标记及α-32P标记混合)，12.μg变性鲱鱼精子DNA，最终体积50μl。
（五)模板
单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。虽然PCR可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的DNA，但为了保证反应的特异性，还应用ng级的克隆DNA，μg水平的单拷贝染色体DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白。
DNA的大小并不是关键的因素，但当使用极高分子量的DNA（如基因组的DNA时)，如用超声处理或用切点罕见的限制酶（如Sal1和Not1)先行消化，则扩增效果更好。闭环靶序列DNA的扩增效率略低于线状DNA，因此，用质粒作反应模板时最好先将其线状化。
模板靶序列的浓度因情况而异，往往非实验人员所控制，实验可按已知靶序列量逆减的方式（1ng,0.1ng,0.001ng等)，设置一组对照反应，以检测扩增反应的灵敏度是否符合要求。
（六)石蜡油
PCR扩增时建议在混合物上面铺一层石蜡油，减少PCR过程中尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失。研究表明，应用石蜡油可使扩增产量增加5倍，可能与石蜡油维持热恒定和整个反应体系中盐浓度有关。
