全球60 亿人口中, 约1/2 人口生活在乙肝病毒(HBV ) 高流行区, 约20 亿人证明有HBV 感染, 3～4 亿人为HBV 慢性感染, 每年约有100 万人死于HBV 感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌(HCC)。2005 年12 月10 日中华医学会肝病学分会和中华医学会感染学分会, 中国肝炎防治基金会联合发布我国首部《慢性乙型肝炎防治指南》, 作为诊治乙肝规范性的行动指南。目前国内检测HBV感染血清学标志物应用较多的仍是ELISA 方法。其有以下缺点: 无法定量、灵敏度低, 由检测原理带来的前带现象无法解决, 易污染, 无法完成HBV 感染的动态观察以及低水平HBV 感染指标检测; 免疫胶体金检测技术可大大缩短检测时间, 不需要特殊设备, 操作简单, 但灵敏度欠佳, 假阳性问题难以克服。
随着科学技术的飞速发展, 先进诊断技术不断出现, 时间分辨荧光免疫分析技术(TRF IA ) 是近年发展起来的无环境污染的高灵敏度免疫标记检测技术。乙肝作为常见病毒感染性疾病之一, 临床上常用ELISA 法定性检测乙肝病毒血清学标志物作为诊断HBV 是否感染的依据, 由于钩状效应和敏感性的原因, 常造成HBV 感染的漏诊。临床实践表明, TRF IA 法定量检测乙肝病毒五项血清标志物对乙肝诊治的临床应用越来越显示出其优越性。
1.材料和方法
1.1 标本来源 收集2004年6 月～2005年9月在我院门诊和病房就诊患者血清标本920份,并分别定量和定性检测HBV 血清免疫学标志的全部结果。所有患者均采集静脉血,于当日分离血清, -70℃保存, 并于1 w 内检测。
1.2 试剂 上海新波生物技术有限公司生产的HBsAg, 抗-HBs, HBeAg, 抗-HBe 和抗-HBc 定量检测试剂盒, 批号为20050720; 北京万泰有限公司生产的ELISA 法定性试剂盒, 批号为B20050101;卫生部临检中心提供的乙肝病毒血清学标志物质控品, 批号20050521。
1.3 仪器 Anytest2000 型时间分辨荧光免疫分析仪,DYNEX-MRX 型酶标仪。
1.4 方法 乙肝病毒血清学标志物定量的TRF IA 法和定性的ELISA 法检测, 均严格按照试剂盒各自说明书和《全国临床检验操作规程》中的要求, 两种方法同时分别对不同浓度的标准品和临床标本进行检测。
1.5 结果判定 ELISA 法定性结果参照试剂说明书中的判定方法, 经过本室严格检测, TRF IA 法检测的不同浓度标准品对应ELISA 法定性检测的结果为: 以HBsAg≥1.0 ng/ml, 抗-HB s≥10 mIU/ml, HBeAg ≥0.5 NCU/ml, 抗-HBe≥4.0 NCU/ml, 抗-HBc≥0.6 NCU/ml 判定为阳性, 反之为阴性, 见表1。
1.6 统计学分析 用Excel管理数据库和SPSS11.0 软件统计分析, 方法学间数据比较用χ2检验。
2.结果
2.1 分别用TRF IA 法和ELISA 法对920 份临床血清标本进行检测, 参照表1 中判定乙肝病毒五项血清学标志物定量的阴阳性的方法,所有标本均经AXSYM免疫分析仪微粒子酶免分析法检测HBV感染血清学标志物验证(此验证方法目前是公认的诊断HBV 感染的血清学方法) , 结果对比如表2。
2.2 TRF IA法的敏感性: 对0.2 ng/ml HBsAg,10 mIU/ml 抗-HBs, 0. 05 NCU/ml HBeAg, 2 NCU/ml 抗-HBe和0.2 NCU/ml 抗-HBc标准样品TRF IA法均可检出, 而ELISA法除抗-HBs为±外, 其余均未检出。
3.讨论
传统的ELISA 方法对乙肝两对半血清标志物定性测定, 只能判断其阴阳性, 无法得知其真正的浓度, 给临床诊断和治疗带来许多不便。而HBV 血清标志物定量检测能较为准确地反映其血清中的含量, 可以间接反映体内HBV 复制活跃程度, 对临床药物疗效评价具有重要意义。两对半定量检测结果的有效性在检测的过程中直接进行了标准量化质控, 分高中低及三个定值质控品; 两对半定性检测的室内质控, ELISA 只能间接进行质控, 分阴阳性质控品, 免疫胶体金检测则不能进行严格的室内质控, 从而来保证检测结果的有效性和溯源性。
在急性乙肝早期能及早检出HBsAg, 确证HBV感染, 缩短窗口期; 其次
, 可发现低浓度HBsAg携带者; 在部分慢性乙肝患者中, 由于机体缺乏对HBV 包膜蛋白的免疫应答, HBsAg 表达较低, 酶标检测可出现HBsAg和抗-HBs 均阴性的情况, 定量检测则可避免这些情况的发生, 为正确判断病情提供依据。定量分析HBsAg 和抗-HBs 的浓度变化, 可预见急性乙肝是否处于恢复期。如HBsAg 浓度降低, 抗-HBs 浓度逐渐升高, 可说明病情正往恢复期发展; 反之,HBsAg 浓度处于较高水平或上升趋势, 而抗-HBs一直处于较低水平, 则易发展为慢性乙肝或病毒携带者。定量分析HBsAg和抗-HBe的浓度变化, 可反映病情变化和治疗效果。定量检测能明确HBsAg 向抗-HBe 转换的时期, 即表现为HBsAg 浓度下降和抗-HBe 升高的过程。高浓度的HBsAg 还可间接提示病毒处于高复制状态, 具有较高的传染性; 高浓度的抗-HBe 一方面提示病情好转, 而在某些时候(如肝功能指标很差) 则可能与www.lindalemus.com肝坏死、肝硬化、肝癌有关; 抗-HBc 浓度的高低可反映病毒感染的状态; 高浓度的抗-HBc提示乙肝急性感染, 恢复期浓度降低; 慢性乙肝呈抗-HBc持续高浓度; 而低浓度的抗-HBc 一般为恢复期或既往感染。对920份临床血清检测结果进行比较, TRF IA 法检测乙肝病毒五项血清学标志物的灵敏度均高于ELISA 法, 并具有较好的重复性, 检测结果显示, 两种方法HBeA g, 抗-HBs 结果一致率较好, 其余3 个指标, TRF IA 法检测阳性率均大于ELISA 法, 具有显著性差异(见表2)。TRF IA 法检测较ELISA 法检测更敏感, 可减少低浓度HBsAg 感染病人的漏诊, 以及隐匿性慢性乙型肝炎的漏诊。TRF IA 检测HBsAg 灵敏度可达012 ng/ml, 而ELASA 检测的灵敏度是2 ng/ml, 极大地提高了检测的灵敏度。
血中HBV-DNA 的存在是HBV 感染最为直接、灵敏和特异的指标, 但我们不能因此而断言病毒基因检测可取代HBV 血清标志物定量检测,基因检测所显示的优越性也恰恰是它的缺陷之所在,我们只能通过它来判断病原体的有无和量的多少,至于病原体进入体内之后的反应(即感染后的免疫应答) , 是判断被感染者病情、治疗反应、预后、以及流行病学调查的重要依据。客观地讲, 基因检测和免疫学定量检测在目前应当互补共存, 绝大多数情况下两者缺一不可。因为乙肝HBsAg 是乙肝病毒的外壳物质, 本身没有传染性, 它的阳性往往提示有完整的病毒颗粒存在, 国外报道HBsAg 阳性患者检测HBV-DNA 阳性率52%, 但HBsAg 单阳性中, HBV-DNA 全为阴性, 这说明血清标志物仅有HBsAg 阳性的患者体内病毒数量比较少, 复制水平也很低不具传染性, 但也有报道称, HBsAg的滴度与HBV-DNA 定量检测结果明显呈正相关。阳性组HBV-DNA 全阴性, 可能是因为HBsAg 滴度低, 当滴度升高时, 常伴有HBeAg, 抗-HBe, 抗-HBc等血清标志物的出现。HBeAg 产生于病毒内部, 与Dane 颗粒呈正相关, 可分泌至血液中, e 抗原阳性是HBV 复制活跃的血清学指标, 血清HBeAg 阳性说明传染性强, 国外报道HBeAg 阳性HBV-DNA阳性率为94%～100%, 当血清HBeAg 转阴后, 可出现抗-HBe, 抗-HBe 阳性说明病毒复制减少, 传染性弱, 但并非没有传染性。小三阳HBV-DNA 阳性率低于大三阳, 但仍高于HBsAg 单阳性组, 抗-HBc-IgG 与Dane 颗粒无关,提示为既往感染, 无传染性。单纯性的抗-HBc-IgG阳性时的HBV-DNA 阳性率多数报道认为在1% 以下。但是抗-HBc 是HBV 感染后血清中最早出现HBV 标志性抗体, 在HBV 感染的“窗口期”, 抗-HBc 往往是唯一可检测出的HBV 血清标志物,ELISA 定性检测的敏感性、特异性、阳性检出率都不如TRF IA 法定量检测。另外乙肝患者恢复期和机体开始产生免疫力时, 血清中可有多种抗体阳性, 抗-HBs, 抗-HBe, 抗-HBc 三抗体之间可出现多种组合, HBsAg 阴性并不能排除HBV 感染, 有的血清仍有一定的传染性。虽然对HBsAg 阴性持有不同的解释, 如: ①HBsAg 含量太少, 现在检测技术无法检出; ②HBV 感染而HBsAg 阴性可为乙肝的一个亚型; ③HBsAg
与检验医学网抗-HBs 结合成复合物,使其在血中难以检测出等诸多影响因素。但是乙肝血清学标志物定量是利用时间分辨荧光定量的方法进行的, 大大地提高了检测水平。
总之, 同人们从接受肿瘤标志物定性到定量的过渡一样, 随着现代乙肝临床诊治的需要, 乙肝血清学标志物定量检测的临床应用价值将显现出来。
