目前最常用的方法是金胺-酚改良抗酸染色法,该法是采用金胺-酚染色法和改良抗酸染色法复染,以提高检出率和准确性。单用金胺-酚染色法或改良抗酸染色法,其效果均不如复染方法。检查时,取患者腹泻的新鲜粪便或经10% 福尔马林固定保存(4℃ 1个月内)粪便,自然沉淀后用吸管尽可能取底部粪便,于载玻片上涂成粪膜,晾干后先用金胺-酚染色,再用改良抗酸染色法复染。
(一)金胺-酚染色法
1.染液配制
lg/L金胺-酚染色液(第一液):金胺1g,石炭酸5.0g,蒸馏水100 ml ;3%盐酸酒精(第二液):盐酸3 ml,95%酒精100 ml ;高锰酸钾液(第三液):高锰酸钾0.5g,蒸馏水100 ml 。
2.染色步骤
滴加第一液于晾干的粪膜上,10~15 分钟后水洗;滴加第二液,1分钟后水洗;滴加第三液,1 分钟后水洗;待干后置荧光显微镜下观察。
低倍荧光显微镜下,可见卵囊为一圆形小亮点,呈现乳白色荧光。高倍镜下卵囊呈乳白或略带绿色,卵囊壁为一薄层,多数卵囊周围深染,中央淡染,似环状;或深染结构偏位,有些卵囊全部为深染;但有些标本可出现非特异的荧光颗粒,应注意鉴别。
(二)改良抗酸染色法(modifieD acid-fast stain)
1.染液配制
石炭酸复红染色液(第一液): 碱性复红4g,95% 酒精20 ml,石炭酸8 ml,蒸馏水100 ml ;10 %硫酸溶液(第二液):纯硫酸10 ml,蒸馏水90 ml (边搅拌边将硫酸徐徐倾人水中);20g/L 孔雀绿液(第三液):20g/L 孔雀绿原液1 ml,蒸馏水10 ml 。
2.染色步骤
滴加第一液于粪膜上,1.5~10 分钟后水洗; 滴加第二液,1~10 分钟后水洗;滴加第三液,1 分钟后水洗;待干后置显微镜下观察。染色后,卵囊为玫瑰红色,圆形或椭圆形,背景为绿色。染色(1.5分钟) 和脱色(2分钟)时间短,卵囊内子孢子边界不明显;染色时间长(5~10 分钟),脱色时间相应延长时,子孢子边界明显,卵囊和子孢子均被染成玫瑰红色,子孢子呈月牙形,共4个,其他非特异颗粒则染成蓝黑色,容易与卫生人才网卵囊区分。
不具备荧光显微镜的实验室,可染色后先在光镜低、高倍镜下过筛检查,见有小红点时再转用油镜观察,这样可提高检出速度和准确性。
(三)金胺-酚改良抗酸染色法
先用金胺-酚染色后,再用改良抗酸染色法复染,然后置光镜下观察。卵囊同改良抗酸染色法所见,但非特异性颗粒被染成蓝黑色,两者颜色显然不同,极易区别,使检出率和准确性都明显提高。