1．原理
某些细菌具有β半乳糖苷酶，该酶可分解邻-硝基苯-β-D-半乳糖苷（ONPG)，生成黄色的邻-硝基酚。
2．方法
用接种环在三糖铁培养基上刮取一环18小时菌龄的菌苔，加于无菌盐水0.25 ml中制成浓厚的菌悬液，加入甲苯1滴，充分振摇，将试管置于37℃水浴中5分钟，加入ONPG溶液0.25 ml，在37℃水浴中保温，于20分钟、4小时、18小时和24小时观察结
果。
3．结果
出现黄色为阳性反应，不变色为阴性反应。通常在20～30分钟内显色。
4．意义
此试验是测定不发酵或迟发酵乳糖的细菌是否产生半乳糖苷酶。由于细菌分解乳糖要有两种酶，一是半乳糖昔渗透酶，另一是半乳糖苷酶。当缺乏渗透酶时，乳糖不能进入细胞，乳糖分解就不能进行。这两种酶都是在乳糖存在的条件下诱导细菌产生。迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG为阳性，如埃希菌属、枸橼酸杆菌属。不发酵乳糖的细菌为阴性，如沙门菌属、变形杆菌属。可用本试验作为迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定方法。
5．试剂
（1)缓冲液：称磷酸二氢钠（NaH2PO4)6.9 g，溶于水45 ml中，用30％氢氧化钠调整pH值为7.0，再加水至50ml，保存在4℃冰箱备用。用前若有结晶可加温溶解。
（2)ONPG溶液：用ONPG 80 mg溶于水15ml中，再加入缓冲液5 ml，即成0.75 mol／L ONPG溶液。保存在4℃冰箱中，该溶液应为无色，若出现黄色，应弃之不用。
