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免疫学实验指导-实验三 细胞免疫检测技术

免疫学实验指导:实验三 细胞免疫检测技术:第三部分 细胞免疫检测技术 体外测定细胞免疫功能,首先需要从人或动物外周血获取有活性的免疫细胞,包括通过分离外周血单个核细胞获取淋巴细胞,如采用尼龙毛柱法和E花结法分离T淋巴细胞等。实验一 免疫细胞分离技术一、外周血单个核细胞的分离 外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells,PBMC)包括血液中的淋巴细胞和单核细胞,PBMC是进行细胞免疫学试验最常用的细

第三部分  细胞免疫检测技术

   体外测定细胞免疫功能,首先需要从人或动物外周血获取有活性的免疫细胞,包括通过分离外周血单个核细胞获取淋巴细胞,如采用尼龙毛柱法和E花结法分离T淋巴细胞等。

实验一  免疫细胞分离技术

一、外周血单个核细胞的分离

外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells,PBMC)包括血液中的淋巴细胞和单核细胞,PBMC是进行细胞免疫学试验最常用的细胞,目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离。

原理】 

PBMC与血液中其它血细胞的比重略有不同,红细胞、粒细胞比重较大(1.092左右),PBMC比重较小(1.075~1.090)。将抗凝血置于一定比重(1.075~1.092)的淋巴细胞分离液之上,经一定速度离心后形成密度梯度细胞层:红细胞、粒细胞比重较大,离心后沉于管底;比重与分层液接近的PBMC,离心后密集于血浆层与分层液的界面;血小板因比重小而悬浮于血浆中,由此可获得较纯的PBMC。

材料

1.淋巴细胞分离液  即聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin,商品名常用Isopaque或Hypaque)分层液,又名Ficoll-Hypaque分层液,比重1.077±0.001。

2.肝素抗凝剂  用Hanks液或生理盐水稀释成1000u/ml,肝素用量约为20u/1ml血。

3.Hanks液  pH7.2~7.4,无Ca2+、Mg2+(配制见附录)。

4.10%小牛血清RPMI1640(配制见附录)。

5.0.4%台酚蓝染色液  用生理盐水配制(配制见附录)。

6.血球计数板、显微镜、水平式离心机;无菌试管、毛细滴管和刻度吸管等。

方法

1.静脉取血1~2ml,注入盛有肝素(约20u/ml血)的无菌试管内摇匀,使血液抗凝,抗凝血用等量Hanks液稀释,并充分混匀。

2.取无菌中试管一支,自管底加入1.5~2ml淋巴细胞分离液(保持分离液液面之上管壁不受玷污)。

3.用滴管将稀释后的抗凝血沿试管壁缓慢叠加于分层液面上,应保持两种液体界面清晰。

4.平衡试管重量后置于水平式离心机内离心2000rpm,20min。离心后管内容物分为三层,上层为血浆和Hanks液,中层为淋巴细胞分离液,下层主要为红细胞和粒细胞。在上、中层界面处有一个富含单个核细胞的白色云雾状狭窄带(图3-1)。

5.将毛细吸管轻轻插到白色云雾层,吸出该层细胞,置入另一支无菌试管中,加入5倍以上体积的Hanks液洗涤细胞2~3次,每次离心1500rpm, 10min,吸弃上清。

6.最后一次吸弃上清后,加入适量含有10%小牛血清的RPMI1640,重悬细胞。取0.1ml细胞悬液与等量0.4%台酚蓝染液混合,于血球计数板上,计数四个大方格内的细胞总数。

7.细胞活力检测  死的细胞可被染成蓝色,活细胞不着色。计数200个淋巴细胞,计算出活细胞百分率。

结果

  4个大方格内细胞总数

PBMC浓度(细胞数/毫升悬液)= ×100×稀释倍数

4

活细胞数

活细胞(%) =  ×100%

总细胞数

用本法分离PBMC,纯度在90%以上,收获率可达80%~90%,活细胞百分率在95%以上。  

红细胞、粒细胞

 

分层液

 

PBMC层

 

抗凝血

 

血浆、Hanks液

 

分层液

 

离心前  离心后

图3-1  PBMC的分离

注意事项

1.将稀释的抗凝血加于分层液上时,要沿管壁缓慢加入,使分层液与血液的界面十分清晰,避免血液冲散分层液的液面而影响分离效果。

2.用毛细吸管吸取富含PBMC的白色云雾层时,动作要轻巧,最好一次吸完,避免将白色云雾层冲混。

3.操作全程应尽可能快地完成,以免死细胞数增加。活细胞百分率过低可能会影响某些试验的正常进行。

4.用淋巴细胞分离液分离PBMC时,必须使用水平式离心机,离心机转速的增加和减少要均匀、平稳,以保持界面的清晰。

5.分离不同动物血中的PBMC,对分层液比重的要求不同,如小鼠为1.088,马为1.090等。

思考题

1.你认为本次试验成败的关键因素是什么?应该怎样把握?

2.现分离得到10ml单个核细胞悬液,加台酚蓝染液对倍稀释后充池计数4大方格,未着色细胞为400,若要校正活细胞浓度为1×105/ml,如何进行校正?若要同时进行细胞活力检测,应如何计数和计算?

3.上述PBMC细胞浓度的计算公式中,乘以100是什么意思?

二、T、B淋巴细胞的分离

T细胞与B细胞表面粘附特性和表面受体不同,借此可将T、B细胞分离开。常用的方法有尼龙毛分离法和E花结分离法。

(一)尼龙毛分离法

原理

B细胞表面凹凸不平,37℃时易粘附于尼龙毛表面,而T细胞表面光滑,无粘附作用。淋巴细胞在通过装有尼龙毛的柱时,B细胞被吸附于柱上,而T细胞不被吸附随液体流出,借此将T、B细胞分离开。

材料

1.标本  外周血单个核细胞(PBMC)悬液。

2.试剂  Hanks液,含20%FCS(胎牛血清)的RPMI 1640培养液。

3.器材  尼龙毛(尼龙纤维,上海化纤九厂,3D尼龙-6短纤维)、水平式离心机、10ml注射器、试管、毛细吸管等。

方法

1.尼龙毛柱的制备

⑴ 将尼龙毛放入烧杯内,加双蒸水煮沸10min,置尼龙毛于漏斗内沥干。重复上述过程6次,最后两次煮沸用去离子水(国产的尼龙毛需事先用0.2N盐酸浸湿数小时,取出后用双蒸水反复冲洗,再按上述方法处理)。

⑵ 称取尼龙毛,将其仔细撕开,使其松散均匀,装入注射器,高压灭菌(可根据过柱的细胞总数来确定注射器的大小和尼龙毛的重量,见表3-1)。

⑶ 用前将柱内尼龙毛用37℃预温的RPMI 1640培养液浸润,于37℃静置30min,然后分别用Hanks液和RPMI 1640培养液各5ml洗柱,流速2ml/10s。

2.1×108个PBMC重悬在1~2ml含20%FCS的RPMI 1640培养液中,将细胞悬液装柱,水平置37℃孵育60min。

3.用37℃预温的含20%FCS的RPMI 1640培养液洗脱尼龙毛柱2次,流速1滴/s。洗脱液中富含T细胞。

4.用冷的RPMI 1640培养液洗脱尼龙毛柱2次,边洗边挤压,洗脱液中富含B细胞。

结果

本法分离所得的T细胞纯度可达80%~90%,B细胞纯度可达70%~80%,细胞活力可达90%以上。可用荧光标记CD3单抗(或E花环形成试验)鉴定T细胞纯度,用抗Ig荧光抗体法鉴定B细胞纯度,用台酚蓝染色法鉴定细胞活力。

表3-1  装尼龙毛柱所用的注射器大小和尼龙毛重量

细胞数量   注射器容量(ml) 尼龙毛重量/注射器  尼龙毛在注射器内体积

1×108   10~12 0.6g 6ml

3×108 351.6g18ml

4×108 352.4g24ml

注意事项

1.尼龙毛柱的质量直接影响到分离效果。尼龙毛柱应均匀、松散、连续、不留气泡。装柱的长度应与分离的细胞成正比,一般柱高6cm,可有效滤过2~3×107个细胞。

2.用手挤压尼龙毛柱时,柱内一定要充满液体。挤压时用力要适度,用力过重,会损伤B细胞,还会将粘附力大于B细胞的单核细胞也随之挤下;用力过轻则会使B细胞流出不全。

3.冲洗尼龙毛柱时应注意溶液及环境的温度。温度过低,B细胞和单核细胞易脱落,使T细胞纯度下降,B细胞得率降低。

4.有些T细胞亚群可能滞留在柱内。

5.尼龙毛可回收利用。用过的尼龙毛可用生理盐水漂洗,然后放入0.1N盐酸内过夜,洗涤程序同前。

思考题

1.尼龙毛分离法分离T、B细胞的原理是什么?PBMC悬液中所含的单核细胞能否除去?为什么?

2.收集B细胞挤压尼龙毛柱时应注意什么?为什么?

3.用该法分离得到的T、B细胞如何进行纯度和活力鉴定?

 

(二)E花结分离法

原理

人类T细胞表面具有能与绵羊红细胞结合的受体(E受体,即CD2),可与绵羊红细胞结合形成E花结。形成E花结后的T细胞,体积和比重较其它细胞大,可通过速率沉降(rate sedimentation,即体积分离)或平衡沉降(equilibrium sedimentation,即密度分离)将T细胞与B细胞加以分离。T细胞形成的E花结在37℃稳定性较差,采用还原剂AET(溴化二氨基异硫氢化物2-amino ethyl isothiourniumbromide bydrobromide)或神经氨酸酶(neuraminidase)预处理绵羊红细胞,可使T细胞形成大而稳定的花结,且花环形成快速、形成率高。经分层液密度梯度离心后,能形成E花结的T细胞沉于管底,而不能形成E花结的细胞(如B细胞和单核细胞)则在分层液的界面。将E花结形成细胞用低渗溶液处理,溶解绵羊红细胞,即可获得较纯的T细胞。

材料

1.阿氏液(配制见附录)、新鲜绵羊抗凝血、pH7.2的PBS、神经氨酸酶、AET、Tris-氯化胺溶液(1mol/L氯化胺以9∶1比例与0.17mol/L Tris溶液混合,调pH至7.2,过滤,4℃保存)、RPMI 1640、淋巴细胞分离液等。

2.试管、毛细吸管、水浴箱、水平离心机等。

方法

1.用神经氨酸酶处理的绵羊红细胞(SRBC)分离T细胞

    ⑴ 神经氨酸酶处理的SRBC的制备 取用阿氏液对倍稀释的绵羊抗凝血20~30ml,用PBS洗涤三次(2000 rpm,5min)。末次洗涤后将绵羊红细胞重悬在20ml RPMI 1640培养基中,加入0.5ml神经氨酸酶(1u/m1),然后置于37℃水浴中孵育30min,再用PBS洗涤SRBC两次。末次洗涤弃上清后,按10%(V/V)加RPMI 1640培养基于试管内混匀,置4℃可存放两周左右。

⑵ 分离T淋巴细胞与B淋巴细胞

将3.0~4.0×106个淋巴细胞重悬在4ml RPMI 1640培养液中,加lml 10%(V/V)神经氨酸酶处理过的绵羊红细胞悬液,混匀。将上述5ml细胞悬液叠加在3ml淋巴细胞分离液上,作密度梯度离心1500~2000rpm,20min,吸出界面云雾状细胞群,它们是未形成E花环的细胞,即B细胞;沉淀于管底的E花环阳性细胞为T细胞群体。

2.用AET处理的SRBC分离T细胞

⑴ 称取402mg AET,溶于双蒸水10ml中配成0.14mol/L溶液。用4mol/L氢氧化钠溶液调pH至9.0,现用现配。

⑵ 取离心洗涤后的SRBC,按压积1∶4的比例加入0.14mol/L AET溶液,充分混匀。37℃孵育15min,每5min摇匀一次。

    ⑶ 用PBS或Hanks液洗SRBC 5次,用RPMI 1640培养液配成1%(V/V)细胞悬液。

⑷ 取2~3×106/ml淋巴细胞悬液与等体积的经1%AET处理的绵羊红细胞悬液混合,37℃孵育15~20min,每5min摇匀一次。低速离心(500rpm,5min),4℃孵育40~45min。将该细胞悬液预温至20℃,叠加于淋巴细胞分离液上作密度梯度离心分离,1500~2000rpm,20min 。余后步骤同神经氨酸酶处理的SRBC分离T细胞法的最后步骤。

结果

沉淀于管底的E花环形成细胞即为T细胞群体,用低渗的Tris-氯化胺溶液溶解绵羊红细胞,即可获得较纯的T细胞。

注意事项

1.约l0%~80%的NK细胞也能表达CD2分子,故用此法分离的T淋巴细胞难免混杂NK细胞。必要时可用Percoll非连续性密度梯度离心法将T细胞与NK细胞加以分离。

2.AET处理的绵羊红细胞悬液4℃可存放一周,但绵羊红细胞悬液有溶血者不宜使用。

3.小牛血清(RPMI 1640培养液中)用绵羊红细胞吸收后使用,可除去小牛血清中的凝集素,从而提高T细胞的分离率。

思考题

1.用E花结分离法分离T细胞的原理是什么?E花结形成细胞均为T细胞吗?为什么?

2.试验中使用的神经氨酸酶和AET的作用是什么?

实验二  E花环形成试验

原理

人类T细胞膜表面有E受体—绵羊红细胞(SRBC)受体,在体外一定条件下,当T细胞与SRBC混合并紧密接触时,可形成以T细胞为中心、四周环绕绵羊红细胞的玫瑰花样花环,光学显微镜下可见,简称E花环(E为红细胞erythrocyte的缩写)。根据E花环形成细胞的多少,即可测知外周血中T细胞的总数,即Et(t为total的缩写)。其中有一部分T细胞的E受体对SRBC有较高的亲和力,经低速离心后,即可与SRBC形成花环,此类T细胞称为活性玫瑰花环形成细胞,即Ea(a为active的缩写)。Ea能反映T细胞的体内功能活性,用以表示机体细胞免疫功能和动态变化;Et则代表被检外周血中T细胞的总数和百分率,一般不反映机体的细胞免疫功能。

材料

1.淋巴细胞(即PBMC)悬液  用含20%小牛血清的Hanks液(无Ca2+、Mg2+)将细胞浓度调成2.5×106/ml。制备方法见淋巴细胞分离技术。

2.Hanks液  不含Ca2+、Mg2+

3.绵羊红细胞(SRBC)悬液。

4.8%戊二醛溶液(用Hanks液稀释)。

5.HE染色液(配制见附录)。

6.水平离心机、水浴箱、冰箱、显微镜、血球计数板等。

方法

1.Et花环试验

⑴ 分离人外周血单个核细胞,计数后配成2.5×106/ml浓度。

    ⑵ 取保存于Alsever液中的SRBC(或适量新鲜配制的SRBC) 5ml,用Hanks液洗涤3次后,取少量经适当(约200倍)稀释后滴于血球计数板内,镜下计数,配成1.8×108/ml浓度。

⑶ 取0.1ml淋巴细胞悬液(2.5×106细胞/ml)和0.1ml SRBC悬液(1.8×108/m1),加于1支圆底小试管内,充分混匀后,置37℃水浴10min。

⑷ 取出后,在水平离心机内离心500rpm,5min,静置4℃冰箱过夜。

⑸ 用毛细吸管吸弃大部分上清液。将试管放在手心轻轻搓动,悬起细胞,加1滴0.8%戊二醛液,轻轻混匀,室温下静置5min以固定细胞。

    ⑹ 将细胞悬液倾于载玻片上,轻轻涂布使面积约为1~2cm2。于室温或37℃温箱使涂片干燥,HE染色(方法见附录),镜检(或在第5步后,在试管内加1%美蓝1~2滴,室温下染色3~5min,取1滴细胞悬液于玻片上,加盖玻片后在高倍镜下计数)。

⑺ 淋巴细胞周围凡有3个以上绵羊红细胞紧密附着者,即为Et花环形成细胞。于油镜下计数200个淋巴细胞中的花环形成细胞数,计算出Et花环形成的百分率。

2.Ea花环试验

    ⑴ 将Et花环试验用的SRBC稀释3倍,使成6×107/ml。

    ⑵ 于圆底小试管内加入0.1ml待检的淋巴细胞悬液(2.5×106细胞/ml)和0.1ml SRBC(6×107/ml),混合后,立即于水平离心机离心500rpm,5min。

⑶ 弃去大部分上清液,轻轻悬起细胞,加1滴0.8%戊二醛液固定,静置5min。

⑷ 其余操作同Et花环试验中的(6)、(7)项。计数Ea花环百分率。

结果

    形成花环细胞数

    E花环形成率(%)=×100%

  形成花环细胞数 + 未形成花环细胞数

淋巴细胞周围凡有3个以上绵羊红细胞紧密附着者,即为E花环形成细胞。健康人外周血Et花环百分率约为60%~70%,Ea花环百分率约为20%~30%。

注意事项

1.SRBC最好用新鲜的,一般采血后保存于Alsever液中,2周内可用。超过2周,与淋巴细胞结合能力下降。

2.从采血到测定不要超过4h,分离的淋巴细胞放置时间也不要超过3~4h,否则SRBC受体会自行脱落。可用台酚兰检查淋巴细胞活力,活细胞数应不少于95%。

3.计数E花环前,应将沉于管底的细胞予以重悬,但只宜轻缓旋转试管,使细胞团块松开即可,不能强力吹打,以免花环解离。

4.整个操作过程的室温以16~23℃较好,过高或过低会使E花环形成率降低。

5.配制PBMC悬液应用10%~20%小牛血清为好。不加小牛血清,E花环形成率降低。

6.SRBC与PBMC的比例,一般以100∶1为宜。

思考题

1.Et花环试验与Ea花环试验的操作步骤有什么不同?二者的临床意义有何不同?

2.为什么PBMC与SRBC混合后要进行离心沉淀?重悬细胞时为什么只能轻缓旋转试管,而不能用力摇匀细胞悬液?

3.E花环形成的原理是什么?是否只有T细胞能形成E花环?

实验三  淋巴细胞转化试验

T细胞在体外培养时,受到特异性抗原或促有丝分裂素,如植物血凝素(PHA)或刀豆素A(ConA)刺激后,细胞内核酸和蛋白质合成增加,同时细胞形态转化为母细胞,即为淋巴细胞转化现象。根据淋巴细胞转化率的高低,可以了解机体的细胞免疫水平,常作为检测机体细胞免疫功能的指标之一。试验方法可采用形态学计数法、3H一胸腺嘧啶核苷(3H—TdR)掺入法等。

一、形态学计数法

原理

T淋巴细胞表面有植物血凝素(PHA)受体,T细胞在体外培养时,当受到非特异性的促有丝分裂素PHA刺激后,进行有丝分裂,可转化为淋巴母细胞,细胞的形态和结构发生明显的改变,通过染色镜检,即可计算出淋巴细胞的转化率。

材料

1.肝素抗凝的新鲜血液标本。

2.1%粗制PHA(PHA—M),无菌生理盐水配制(所选用的PHA,最好先测定最适浓度)。

3.细胞营养液  含20%小牛血清的RPMI 1640,每毫升营养液含青、链霉素各200单位(小牛血清要经56℃30min灭活)。

   4.0.87%NH4Cl溶液。

    5.瑞氏染液(或姬姆萨染液)。

6.水平离心机、培养小瓶、吸管、显微镜等。

方法

1.细胞培养 取培养小瓶按下列顺序加入样品和试剂

⑴ 3ml细胞营养液。

⑵ 1ml肝素抗凝全血。

    ⑶ 实验瓶内加0.2m1 PHA(对照瓶内不加PHA)。

⑷ 混匀后将小瓶以30~45度的角度放入37℃温箱培养72h。

2.制片  

⑴ 吸弃瓶内上清液。  

    ⑵ 取0.87%NH4Cl溶液3ml左右(一般为血球体积的5倍),加入瓶内充分混匀,置37℃15min以破坏红细胞。

⑶ 瓶内细胞悬液移至离心管内,加适量生理盐水混匀后,1000rpm,10min,洗涤两次。

⑷ 吸弃上清,将混匀后细胞沉淀物取样推片,待干燥后作瑞氏染色(染色液配制见附录)。

    3.镜下计数  

分别取推片头、中、尾三段,计数200个淋巴细胞,包括转化和未转化的淋巴细胞。以下三种均可作为转化的淋巴细胞(见表3-2):

⑴ 淋巴母细胞  体积明显增大,为成熟淋巴细胞的3~4倍。核膜清晰、核染色质疏松呈细网状。核内见明显核仁1~4个。胞浆丰富,嗜碱性,有伪足样突起,胞浆内有时可见小空泡。

⑵ 过渡型淋巴细胞 具有上述淋巴母细胞的某些特征。核质疏松,可见核仁,胞浆增多,嗜碱性强。比静止淋巴细胞大。

⑶ 核分裂细胞 核呈有丝分裂,可见许多成堆或散在的染色体。

结果

据上述形态学指标,计算出淋巴细胞转化的百分率

 转化的淋巴细胞数

淋巴细胞转化率(%) =  ×100%

 转化和未转化的淋巴细胞总数

淋巴细胞转化率能反映细胞免疫功能,正常值为60%~80%。

注意事项

1.形态学计数法不需特殊设备,没有放射性污染,一般实验室均可采用。但判定结果受主观因素影响较大,重现性较差,测定效率低,已逐渐被同位素掺入等方法所取代。

2.培养瓶的玻璃质量可影响转化率,可选用中性玻璃小瓶(如链霉素或胰岛素瓶);培养瓶应有足够的空间,一般10ml小瓶加2ml培养基较好。

表3-2 淋巴细胞转化的形态学特征

    未转化淋巴细胞   过渡型淋巴细胞  转化型淋巴细胞

细胞大小 6~9μm    12~16μm  12~20μm

核大小  核较小、嗜碱性强 核增大、嗜碱性减弱   核大、嗜碱性减弱

染色质致密 疏松疏松可呈网状

核仁  无  有或无  清晰,1~3个

胞浆   极少增多,嗜碱性   增多,嗜碱性

浆内空泡  无  有或无 有或无

 


思考题

1.是否可用特异性抗原作为刺激剂进行淋巴细胞转化试验?如果可以,其机制是什么?转化率与用非特异性有丝分裂素作为刺激剂比较,哪个转化率高?为什么?

2.除了PHA外,还可用其它非特异性有丝分裂素进行淋巴细胞转化试验吗?

二、3H—胸腺嘧啶(3H—TdR)掺入法

原理

T淋巴细胞受特异性抗原或PHA刺激后,在转化为淋巴母细胞的过程中,DNA合成明显增加。细胞转化程度愈高,DNA合成也愈多。此时若将合成DNA的前体物质胸腺嘧啶核苷用放射性同位素3H(氚)标记,加入到培养系统中,即可被转化的淋巴细胞摄取而掺入DNA分子内,培养终止后,测定淋巴细胞内掺入的3H—TdR的放射量,即能判定淋巴细胞的转化程度。此法较形态学计数法客观、准确,重复性也好,但需一定设备条件。

材料

l.肝素抗凝的新鲜血液标本。

2.植物血凝素(PHA,1mg/ml)。

3.细胞营养液(配制方法见附录)。

4.3H—TdR  100微居里/ml。

5.蒸馏水、5%三氯醋酸、无水乙醇

6.玻璃纤维滤膜及负压抽滤装置。

7.闪烁液(配制方法见附录)及液体闪烁计数仪等。

方法

   (一)微量全血法

1.每份血标本用6个培养瓶,分别加入2ml细胞营养液和0.2ml肝素抗凝新鲜血液。

2.在第1~3瓶内各加PHA 0.1ml(最终浓度为25~50微克/毫升)。第4~6瓶不加PHA作为细胞对照。

3.放37℃恒温箱内培养3d。终止培养前12~18h,每瓶内加入3H—TdR 1微居里/10微升,继续培养。

4.终止培养后,每瓶内加入蒸馏水5毫升,溶解红细胞。分别吸出各瓶材料置玻璃纤维滤膜上,经负压抽滤除去未掺入细胞内的游离3H—TdR。再依次用5%三氯醋酸固定,无水乙醇脱色。

5.将玻璃纤维滤膜置60~80℃烘干,顺次放入测量瓶内,加5毫升闪烁液,置液体闪烁计数仪内测量样品的放射性,以每分脉冲数(cpm)表示。

   (二)分离淋巴细胞3H—TdR掺入法

此法原理、材料同上。

1.按“外周血淋巴细胞分离技术”分离和制备淋巴细胞悬液,用细胞营养液调整细胞浓度为1×106/ml。

2.试验在96孔微量培养塑料板上进行,每份标本加6孔。3孔为试验孔(3个复孔),每孔加细胞悬液0.1ml、PHA 20μg/0.1ml。另外3孔为对照孔,每孔加细胞悬液0.lml,营养液0.1ml。

3.置37℃ 5%CO2培养箱56h后,每孔加3H—TdR 1微居里/10μl,继续培养16h。

4.终止培养,用多头细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤纸上。用生理盐水充分洗涤,以洗除游离的3H—TdR。

5.滴加5%三氯醋酸5ml固定细胞,并除去酸溶性小细胞。

6.滴加无水乙醇5ml脱水、脱色。

7.同上法“5”。

结果

1.计算刺激组(加PHA刺激)及细胞对照组(未加PHA)3份样品的cpm均值(每一标本作三份复管)。

2.计算刺激指数(stimulating index,SI)作为判断淋巴细胞转化程度的指标。

 刺激组(加PHA刺激)cpm均值

刺激指数(SI) =

  对照组(未加PHA刺激)cpm均值

注意事项

1.PHA在刺激淋巴细胞转化时有一个最适浓度,浓度过高或过低都会降低淋巴细胞的转化率。

2.本试验细胞培养时间较长,故整个试验过程应注意无菌操作,否则因污染会导致实验失败。

3.实验过程中使用的同位素,须严格按照同位素操作规则进行操作,以防污染环境。

4.同位素掺入法的影响因素较多,如细胞浓度、PHA浓度、培养时间、培养液成分及3H—TdR的活性等,故应严格控制实验条件。

思考题

1.试比较形态学计数法和3H—TdR掺入法进行淋巴细胞转化试验的优缺点。

2.为什么PHA能刺激人的T细胞转化而不能刺激B细胞转化?

实验四  白细胞移动抑制试验

原理

致敏T细胞在体外与相应抗原再次接触或正常人的T细胞受有丝分裂原(如PHA)刺激,可产生多种细胞因子,如巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migrationinhibitory factor,MIF)和白细胞移动抑制因子(leucocyte migrationinhibitory factor,LIF),可分别抑制巨噬细胞和白细胞的移动。据选择的指示细胞(巨噬细胞或白细胞)不同,可分为巨噬细胞移动抑制试验和白细胞移动抑制试验,以后者较为常用。原因是T细胞与其它白细胞可同时从外周血中获得,二者不需分离,操作简便。根据白细胞的移动受LIF抑制的程度,可判断受检者的细胞免疫功能。

材料

    1.肝素抗凝血2ml。

    2.毛细玻璃管 长70~80mm,内径0.7mm,干烤灭菌。

3.培养小室  用玻璃板(或有机玻璃)制成,内径2cm,高0 .5cm。用前洗净、晾干,置紫外灯下照射1h灭菌。

4.26×26mm灭菌盖玻片。

5.含20%小牛血清的RPMI 1640培养液。

6.PHA原液浓度8mg/ml,使用时用1640培养液配制成1∶100和l∶500两种浓度。(抗原则按实验目的不同而选定,常用1/10或1/100稀释的旧结核菌素)。

7.有盖搪瓷盘、白凡士林、小镊子、砂轮、投影仪及分离淋巴细胞的所需器材。

方法

1.采用密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞,计数收获淋巴细胞总数。

2.制备红细胞悬液  使其浓度达109/ml,并用红细胞悬液调节白细胞浓度至5×106/ml(白细胞向毛细管外移动游走时,红细胞因其浓度大而被动地被白细胞带出管外,使结果更易观察)。

3.用虹吸法将混合血细胞收入毛细管内,吸入高度约60mm,并将玻管无细胞端用火焰封口,每一标本共制六支毛细管。

4.将毛细管放入垫有少许棉花的试管中(毛细管开口端向上),于水平式离心机中离心2000rpm,20min。

5.用砂轮于上清液和细胞界面处截断毛细管。

6.用镊子夹取盛有压积细胞的毛细管,将其封闭端用白凡土林少许粘于培养小室内,并使开口端朝向小室中央,每个小室放一支。

7.于两个小室内分别注满含有1/100、l/500PHA的营养液,另用不含PHA的营养液注入另一个小室作为对照。试验组和对照组均设复管。

8.在培养小室边缘涂凡士林少许,加盖坡片封闭小室(注意不要在小室内留有气泡),将小室放入湿盒,于37℃温箱中培养13~24h后观察结果。

结果

1.在投影仪下画出试验组与对照组白细胞移动图象,测得白细胞移动面积,得出各组平均值(图3-2)。

2.计算移动抑制指数(MI)

试验组细胞移动面积均值

移动抑制指数(MI) =  

对照组细胞移动面积均值

MI在0.8~1.2之间为正常值,表示机体对该抗原无特异性细胞免疫作用;MI<0.8,为移动抑制试验阳性反应,表示机体对该抗原有特异性细胞免疫作用。

移动抑制试验是检测机体细胞免疫状态的一种体外试验,与皮肤迟发型超敏反应试验相关性较好,可用于肿瘤免疫、移植免疫、自身免疫性疾病和传染性疾病等的研究。

对照组(不加PHA)     实验组(加PHA)

图3-2  白细胞移动抑制试验示意图

注意事项

1.毛细管内径、管壁厚薄要尽量一致。

2.水平离心后,白细胞不宜放置过久,在空气中暴露时间不宜过长。

3.各管的细胞悬液高度要尽量一致。

思考题

1.T淋巴细胞在什么情况下产生LIF?检测LIF有何实际意义?

2.致敏T细胞在特异性抗原刺激下还可产生哪些重要的细胞因子?

实验五  白细胞介素2的诱生与活性测定

一、白细胞介素2(IL-2)的诱生方法

1.常规分离PBMC,用含10%FCS RPMI 1640液调整细胞浓度至1×106/ml。

2.细胞悬液加入24孔培养板,1ml/孔,加入PHA 125μg/孔,37℃CO2培养箱培养48h。

3.离心2000rpm,20min,收集上清液,-20℃冻存待检。

二、IL-2的活性测定

 (一)3H—TdR掺入法

原理

白细胞介素2(interleukin 2,IL-2)由活化Th细胞产生,是T细胞进行克隆扩增以及维持T细胞在体外生长所必需的一种重要的细胞因子。检测IL-2活性的原理是:由于T淋巴细胞在体外必须有IL-2才能生长,故可选用对IL-2呈依赖性的T淋巴细胞株(如CTLL-2)进行检测。在CTLL-2培养过程中,加入待测标本(如用PHA刺激的PBMC培养上清液),如果CTLL-2得以生长,表明待测标本中含IL-2。且CTLL-2对IL-2的需求,在一定范围内呈剂量依赖性,因此,可以根椐CTLL-2细胞生长的程度,对IL一2活性定量测定。

CTLL-2(cytotoxic T-lymphocyte line 2)是来源于C57BL/6小鼠的细胞毒T细胞系,对IL-2有依赖的特性,即只能在有IL-2存在的培养基中才能生长,因此可作为指示细胞来测定待检样品中IL一2的水平。除CTLL-2外,丝裂原活化的T淋巴母细胞和小鼠胸腺细胞亦可作为检测IL-2活性的指示细胞。

材料

1.检测细胞 CTLL-2(一株小鼠来源的IL一2依赖细胞株)。

2.待测IL一2样品  用PHA刺激的PBMC培养上清液。

3.已知活性为100u/ml的IL一2标准品,10%FCS RPMI1640。

4.浓度为1mci/ml的3H标记的胸腺嘧啶核苷(3H—TdR)。

5.微量细胞收集仪、液体闪烁计数器。

6.PP0(2,5-二苯基恶唑,2,5-diphenyloxazole)、POPOP[1,4双(2’-c5’苯基恶唑)苯,1,4-di-(2’-c5’-phenyloxazolyl)-benzene]、二甲苯。

方法

1.制备CTLL-2细胞悬液  收集生长良好的CTLL-2细胞,1500rpm,5min,用10%FCS RPMI1640洗涤细胞两次,制成细胞悬液。取一滴用0.5%台酚蓝染色检测细胞活力(应在95%以上)。调整细胞浓度至1×l05/ml。

2.加样 将标准品和待测样品分别作倍比稀释。按每孔100μl加入96孔平底培养板中,每个稀释度各加3个复孔。然后,每孔加入CTLL-2细胞悬液l00μl。另设3个对照孔,只加100μl细胞和100μl培养液,不加IL-2。加样后,培养板置37℃5%CO2培养箱中孵育24h。

3.同位素的掺入及计数  在培养终止前6~10h加入同位素,每孔加入lμci 3HTdR。培养结束后立即用微量细胞收集仪收集细胞。液体闪烁计数测定每管的cpm值。

结果

  待测样品cpm最大值50%所需稀释度

IL-2活性(u/ml)=  ×标准品活性

 标准品cpm最大值50%所需稀释度

3HTdR掺入法测得各孔cpm值后,可计算IL-2的活性单位。首先计算出细胞增殖强度R(R为IL-2孔的cpm值),不同IL-2稀释度时的R值不同。以IL-2稀释度为横坐标,R值为纵坐标,绘制出两者的关系曲线,由曲线查得最大R值。然后找出50%最大R值相应的IL-2稀释度,称为1个IL-2活性单位。

例如:IL-2检测样品的一个活性单位为1∶32,则此样品中含IL-2的浓度为32u/ml。若与已知单位的IL-2标准品比较,即可计算出样品的标准单位。假设IL-2标准品为50μg/ml,在本次试验测得50%最大R值为1∶40;待测样品的50%最大R值为1∶32,则其IL-2的标准单位数(N)可由下式计算:

N = 50μg/ml ×(32/40)

注意事项

    1.CTLL-2在体外长期维持培养比较困难,若条件不具备,可改用ConA激活小鼠胸腺细胞作为检测细胞,方法类似。

2.待测IL-2粗样品中常含低分子量的抑制因子,可经透析后再检测,以提高结果的准确性。

3.检测IL-2活性前需充分洗涤CTLL-2细胞,目的是除去残留的IL-2,以免干扰检测结果。但操作必须轻柔,离心速度不宜过高。

4.加入3HTdR的最适时机是阴性对照细胞趋于全部死亡。

5.CTLL-2细胞冻存后复苏较困难,用含丝裂原的培养基长期培养易发生变异。

6.避免同位素污染。

7.加入标准IL-2或待检样品时,按从低浓度到高浓度顺序加入。

思考题

1.IL-2主要由何种细胞产生?检测IL-2的活性有何实际意义?

2.为什么说CTLL-2细胞在体外长期维持培养比较困难?

3.简要说明IL-2的诱生过程及其主要生物学作用。

  (二)MTT比色法

原理

白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)是由Th细胞产生的一种细胞因子,在淋巴细胞增殖分化过程中起着非常重要的作用,而且能维持T细胞在体外长期生长。MTT比色法的原理是以DNA合成酶活性为指标,检测IL-2的活性。CTLL-2是一株IL-2依赖性T淋巴细胞株,只有在IL-2存在的条件下,CTLL-2才能增殖、分裂。细胞增殖活跃时线粒体中琥珀酸脱氢酶活性增加,该酶能使黄色的MTT氧化后形成蓝色结晶状颗粒(formazan),蓝色颗粒formazan的量与IL-2活性水平成正比,通过比色法进行定量。

MTT比色法具有简单,快速,敏感的特点,在掌握良好的试验条件下,其敏感性可接近3HTdR掺入法,且不需要接触同位素。

材料

    1.PRMI 1640细胞培养液  内含2mol/L谷氨酰胺,25mol/L HEPES,青霉素100u/m1,链霉素100u/ml及10%灭活小牛血清。

2.PBS-G  含0.5%葡萄糖的磷酸缓冲液(PBS)0.02mol/L,pH7.2。

3.MTT  3-[4,5-Dimethythiajol一2yl]一2,5一diphenyltetrajolium bronide,中文名为3-(4’,5’-二甲噻唑-乙基)-2,4-二苯四唑嗅盐,用PBS-G配成1mg/ml使用液,4℃避光。

4.DMSO(二甲基亚砜)。

5.IL-2标准品  活性为500u/m1。

6.CTLL-2  一株来源于小鼠的IL一2依赖细胞株。

方法

    1.制备CTLL一2细胞悬液  收集生长良好的CTLL-2细胞,用RPMI 1640细胞培养液洗涤细胞两次,1500rpm,5min。然后制成细胞悬液,用0.5%台酚蓝液染色检测细胞存活率(应在95%以上),调整细胞浓度至1×105/ml。

2.加样 将标准品及待测样品作倍比稀释,按每孔100μl加入96孔平底细胞培养板中,每个稀释度三个复孔。然后,每孔加CTLL-2细胞悬液100μl。另设三个对照孔,只加100μl细胞和100μl培养液,37℃5%CO2条件下培养32~40h。轻轻吸弃上清液l00μl,加入MTT溶液(1mg/ml)50μl。于振荡器上振荡1min,放置37℃、5%CO2孵育箱内反应2h。取出培养板,2000rpm,5min,吸弃上清液,每孔加入DMS0 120μl,振荡30s后,在酶标仪540nm处读取OD值。

结果

   待测样品OD值最大值的50%所需稀释度

 IL-2活性(u/ml) =  ×标准品活性

 标准品OD值最大值的50%所需稀释度

注意事项

1.检测IL-2活性前需充分洗涤CTLL-2细胞,目的是除去残留的IL-2,以免干扰检测结果。但操作必须轻柔,离心速度不宜过高。

2.具体计算方法可参照3HTdR掺入法的结果计算举例。

思考题

1.试述MTT比色法和3HTdR掺入法检测IL-2活性的优缺点。

2.MTT比色法检测IL-2活性的原理是什么?可否把MTT比色法用于淋巴细胞转化试验?

3.检测IL-2的生物活性与采用ELISA法检测血清中IL-2水平的临床意义有何不同?    

 

实验六 CTL杀伤功能测定——51Cr释放法

原理

细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)对靶细胞的杀伤作用具有特异性,即由某种抗原致敏的CTL,只对带有相同抗原的靶细胞产生杀伤作用。如单向MLR诱导产生的CTL,在杀伤靶细胞时 ,必须识别相应的同种异型抗原,并受到MHC的限制。CTL的杀伤功能常采用51Cr释放试验进行检测,当用同位素铬酸钠(Na251CrO4)标记靶细胞时,铬酸盐离子(51CrO42-)以渗透方式进入细胞浆并与细胞浆内蛋白质结合。当这种细胞被效应细胞杀伤后,胞浆内51Cr从细胞膜损伤或裂解处释放出来,测定所释放的同位素量可反映CTL杀伤作用的强度。

材料

1.动物  不同H-2的近交系小鼠。

2.靶细胞  已知H-2的瘤株,如P815(H-2d)。

3.试剂 Na251CrO4溶液,比活性250~500mci/mmol,浓度l mci/ml(英国Amersham)或28mci/ml(北京原子能所)。2.5%Triton X-100、0 .5%台酚蓝染液、丝裂霉素C、Tris-氯化铵溶液(溶解小鼠脾细胞中夹杂的红细胞)。完全培养液(CM)、BSS/10(含10%小牛血清的平衡盐溶液)。

4.器材 培养瓶、玻璃滴管、离心管、试管架、血球计数板、定量加样器及加样塑料头、青霉素瓶、96孔微量细胞培养板(圆底或平底)。倒置及光学显徽镜、水平式离心机及盛放96孔培养板的离心用吊蓝、γ计数仪(瑞典LKB公司)、CO2培养箱。

方法

1.效应细胞的制备 

用单向混合淋巴细胞培养诱导产生CTL。按常规方法制备反应细胞(除去红细胞的甲小鼠脾细胞)。刺激细胞按下面步骤制备:选择H-2与甲鼠不同的乙品系小鼠,制备除去红细胞的脾细胞悬液,置于25m1培养方瓶内,平卧接受60钴2.000rad γ射线照射。以CM洗涤一次后,调整细胞至所需浓度;或用25μg丝裂霉素C/l×107脾细胞/ml浓度处理,经37℃、水浴30min后,依次用BSS/10洗涤二次和CM洗涤一次后,调整细胞至所需浓度。用台酚蓝染色检测细胞活力,要求活细胞>90%。

将2×107反应细胞(甲小鼠脾细胞)与2×107刺激细胞(γ射线照射或丝裂霉素C处理的乙小鼠脾细胞)混于20ml CM中,加入体积为50ml培养方瓶内(底面积2×4cm2,液面高3cm)。轻轻旋上瓶盖,并设单纯反应细胞或刺激细胞的对照瓶。在37℃、饱和湿度、5%CO2条件的培养箱内培养4d或5d。

2.靶细胞的制备 医.学全在线

若在MLC中诱导的是H-2d抗原特异性的CTL,可采用DBA/2小鼠肥大细胞瘤株P815(H-2d)为靶细胞。同位素标记靶细胞的方法是先常规培养P815细胞,实验前一天换上新鲜培养液,实验当天检测细胞活力需大于95%。然后,取2×106/0.5ml P815细胞加入100μci Na251Cr04,37℃水浴2h,结束后洗涤3次,调整细胞浓度至l×105/ml。

3.细胞毒试验

收集效应细胞入离心管内,取离心后细胞沉淀部分,用CM调节活细胞浓度至l.0×107/m1,并可根据不同效靶比例要求,对倍稀释成5×106/ml、2.5×106/ml、1.25×106/ml细胞悬液。然后在96孔板中加入1×104/0.1ml的标记细胞,实验孔加入不同比例的效应细胞0.1ml,自然释放孔加入0.1ml CM,最大释放孔加入0.lml 2.5%TritonX-100,每组3~4个复孔。再经500rpm,30s离心,使效、靶细胞接触,然后置CO2培养箱内温育4~6h,最后经1000~1500rpm,5~10min离心沉淀,依次吸出每孔中上清液0.1ml置于小塑料管内盖紧,在γ计数仪上进行测定。

结果

分别计算实验组、自然释放组及最大释放组cpm,按下列公式进行计算

   实验组cpm – 自然释放组cpm

  51Cr特异性释放率 =   ×100

  最大释放组cpm – 自然释放组cpm

四小时自然释放率>10%~15%

最大释放率通常>90%

特异性释放率随效/靶比例6.25∶l、12.5∶1、25∶l、50∶1和100∶l而递增,两者间常呈相关性。由于CTL特异性杀伤力强,一般采用的效/靶比例为50∶1。

注意事项

1.细胞活力大小是实验成败的关键,故操作时动作要迅速。培养过程使pH恒定在7.2~7.4之间。

2.靶细胞处于对数生长期标记率高。为此,实验前一天务必换液,确保细胞生长良好。在靶细胞标记过程中,由于51Cr进入靶细胞浆内,细胞脆性增大,因此震荡动作要轻揉。

3.51Cr自然释放率常随效靶细胞作用时间延长而偏高,如作用时间为18h,自然释放率可高于20%,故宜做短程试验;51Cr半衰期短,存放时间最好不要超过2个半衰期,否则标记率低,自然释放率高。

4.国产51Cr比活性低,欲达到要求的放射强度,务必加大51Cr用量,这就不可避免地增加了铬含量,造成对靶细胞损伤,致4h自然释放率往往超过允许范围(>15%)。此时只能中止实验。

5.经单向MLR后,培养物中包含不少死细胞,有条件可采用20%Metrizamide分离去之。

思考题

1.CTL杀伤靶细胞的机制是什么?与补体的溶细胞机制有何区别?

2.怎样理解CTL杀伤靶细胞时的抗原特异性和MHC限制性?

3.如欲检查某种肿瘤抗原或免疫原性治疗药物与CTL杀伤功能的关系,怎样设计试验?

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