第一部分 血清学技术
血清学技术指传统的抗原抗体体外检测方法，根据反应现象和试验方法的不同可分为沉淀反应、凝集反应、溶解反应和补体结合反应等类型，广泛用于各类微生物抗原或其抗体、其它蛋白质抗原或其抗体的检测。虽然现有更为灵敏快速的方法和自动化检测仪器，但血清学技术仍然是免疫学检验的基础与核心。血清学技术的第一步是获得高纯度、强特异性的抗原或抗体。
实验一 免疫血清的制备
适量抗原经合适的途径注射动物，能激发动物产生免疫应答，使其B细胞分化成浆细胞，产生特异性抗体并释放入血。当血中抗体达到一定效价时采血，即可获得特异性免疫血清(通常称之为抗血清)。由于抗原分子具有多种抗原决定簇，可分别激活具有不同抗原识别受体的B细胞产生相应的抗体，即多克隆抗体(polyclonalantibody)。目前人工制备的特异性抗体有多克隆抗体，单克隆抗体和基因工程抗体等。抗体是免疫学实验中常用的材料，已知的诊断血清(抗体)常用于对抗原的分析鉴定和定量检测。
针对某种抗原制备特异性抗血清是免疫学的基本技术之一。根据抗原的生物学和理化特性，可用不同的方法制得高纯度的免疫原；再进行不同形式的处理(例如加入佐剂)，可使其具有更强的免疫原性。
本试验以伤寒沙门菌H抗原和O抗原、绵羊红细胞(SRBC)和人全血清为免疫原，以家兔为免疫动物，制备兔抗伤寒沙门菌、兔抗SRBC和兔抗人血清的免疫血清。要求学生初步学会免疫原和佐剂的制作及免疫血清制备的基本方法，了解其意义和应用，熟悉动物实验的基本知识。
一、伤寒沙门菌抗血清的制备
【原理】
伤寒沙门菌H抗原为鞭毛抗原，属鞭毛蛋白质，不稳定，可经甲醛固定；O抗原为菌体抗原，属细胞壁脂多糖，性质稳定、耐热。将制备好的H、O抗原分别免疫健康家兔，家兔体内可产生高效价的抗H抗体和抗O抗体，并主要存在于兔血清中。
【材料】
1．菌株 伤寒沙门菌标准菌株(H901)、伤寒沙门菌标准菌株(O90l)。
2．培养基 普通琼脂培养基、普通琼脂平板、普通琼脂斜面培养基、肉汤培养基。
3．生理盐水、0.4%甲醛生理盐水、37℃水浴箱、恒温培养箱。
4．无菌三角瓶、试管、刻度吸管、水平离心机、接种环、酒精灯。
5．Brown氏标准比浊管。
6．健康家兔(体重为2～2.5kg)。
7．无菌注射器(2ml)、5号针头、2%碘酒、75%酒精、无菌棉签等。
【方法】
1．制备伤寒沙门菌H抗原
⑴ 接种经鉴定的伤寒沙门菌H90l菌株至普通琼脂平板内，37℃培养16～24h，挑选典型光滑型菌落转种至普通琼脂斜面，37℃培养18～24h。
⑵ 加5ml无菌肉汤至接种有细菌的普通琼脂斜面上，静置5～10min，搓动试管，制成细菌悬液。
⑶ 将细菌悬液种于15cm琼脂平板内，尽量铺平于培养基表面(可用涂布棒涂布)，37℃培养16～24h。
⑷ 用适量无菌0.4%甲醛生理盐水冲洗刮取菌苔，移入无菌三角瓶内，置37℃水浴24h，固定杀菌。
⑸ 取少许经甲醛生理盐水处理的菌液接种肉汤培养基作无菌试验。无菌生长者用无菌生理盐水稀释至5～10亿菌／ml(用Brown氏标准比浊管测定)，即获得伤寒沙门菌H抗原，4℃保存备用。
2．制备伤寒沙门菌O抗原
采用经鉴定的伤寒沙门菌O90l菌株，方法同上。收获细菌时，取出大平皿，用适量生理盐水冲洗刮下菌苔，移入无菌三角瓶，100℃水浴2h杀菌(或用0.5%石炭酸盐水冲洗刮下菌苔，置37℃水浴过夜杀菌)。作无菌试验合格后，用生理盐水稀释成5～10亿／ml，加入石炭酸至终浓度为5%即成O抗原菌液。4℃保存备用。
3．动物的选择
选择合适的动物进行免疫极为重要，除了要求动物健康外，还应考虑以下两个因素：⑴抗原与免疫动物的种属差异越远越好；亲缘关系太近不易产生免疫应答(如兔－大鼠之间，鸡－鸭之间)；⑵抗血清量的需要：大动物如马、骡等可获得大量血清(一头成年马反复采血可获得10000ml以上的抗血清)；但有时需要抗体的量不是很多，选用家兔或豚鼠即可。本实验选用家兔较合适。选好动物后，检测其体内是否含有天然抗体(取兔耳缘静脉血，分离血清，分别与伤寒沙门菌H和O抗原做试管凝集反应)，只选择不含伤寒沙门菌H和O抗原天然抗体的家兔进行免疫。最后，将家兔随机分为2组，做好标记。
4．免疫方法
免疫前，用生理盐水将伤寒沙门菌H和O抗原洗涤3遍，然后稀释至9亿菌／ml。兔耳缘经碘酒和酒精消毒后，从耳缘静脉注射抗原(分H抗原和O抗原两组)，按表1-1进行。
表1-1 制备伤寒诊断血清的免疫程序
| 免疫日程(d) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 注射剂量(ml) | 0.1 | 0.2 | 0.5 | 1.0 | 2.0 | 2.0 | |
5．检测血清效价
末次注射后7～10d，抽兔耳静脉血1ml，分离血清与相应的抗原作试管凝集反应，若血清效价大于1∶1280，即可收获血清。若效价偏低，再用相应抗原3ml加强免疫1～2次，可使抗体效价明显升高。
6．收集血清
试血合格后，经颈动脉或心脏采血，置于干燥无菌的三角瓶内，37℃30min，再置4℃冰箱，使血清析出，吸出血清成分以2000rpm离心20min，弃红细胞；检测凝集效价后，适量分装，－20℃冻存备用，也可加入0.01%的叠氮钠(NaN3)防腐。
附：常用采血方法介绍
1．颈动脉放血法 是最常用的方法，对家兔、山羊等动物皆可采用。在动物颈外侧做皮肤切口，拉开皮肤后可见斜行的胸锁乳突肌，将此肌钝性分离并推向后方，即可见到淡红色有弹性的总动脉。将此动脉轻轻游离(连同与之同行的迷走神经)，用丝线将远心端结扎，近心端用止血钳夹住，另一止血钳夹住动脉迷走神经，用以固定。沿结扎处剪断血管，用固定止血钳将断端放入瓶口，慢慢打开夹持的止血钳，动脉血立即喷射入瓶。如此放血的速度快，动物死亡也快，取血量略少于其他放血法。如在放血大约总量的一半时，暂时将动脉夹住片刻，再继续放血，得血量可以多些。
2．心脏采血法 多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动物。采血技术应熟练，穿刺不准容易导致动物急性死亡。
3．静脉多次采血法 家兔可用耳中央静脉，山羊可用颈静脉。这种放血法可隔日一次，有时可采集多量血液。如用耳静脉切开法，一只家兔可采百余毫升血液(用颈动脉放血最多可获70～80ml，一般只有50ml左右)。用颈静脉采集绵羊血，一次可放300ml，放血后立即回输10%葡萄糖盐水，三天后仍可采血200～300ml。动物休息一周，再加强免疫一次，又可采血二次。如此，一只羊可获1500～2000ml血液。小鼠取血往往采取断尾或摘除眼球法，每鼠得血一般不超过2ml。
抗血清的分离多采用室温自然凝固，然后放置37℃或4℃待凝块收缩。前者迅速，但得血清较少；后者时间长，有时还会出现溶血，但获得血清多，而且效价不易下跌。
二、溶血素的制备方法
【原理】
绵羊红细胞(SRBC)对家兔、小鼠等动物属于异种抗原。用SRBC悬液免疫家兔，家兔可针对SRBC的刺激产生体液免疫应答，合成和分泌大量抗SRBC抗体，主要存在于被免疫兔的血清中。
在试管内抗SRBC抗体与SRBC可发生结合，加入补体后，在一定条件下，经一定时间会导致SRBC的溶解，故抗SRBC抗体又称为溶血素。
【材料】
1．健康绵羊。
2．采血器材 无菌注射器(50或100ml)、16号针头、剪刀、止血带、酒精灯、无菌棉球、2.5%碘酒、75%酒精等。
3．无菌三角瓶(内装阿氏红细胞保存液)、无菌离心管和吸管、橡皮乳头、血球计数器等。
4．无菌生理盐水、水平离心机。
5．健康家兔。
【方法】
1．制备绵羊红细胞悬液
⑴ 用带子交叉捆住绵羊四肢，使其侧卧于地。剪去颈部部分毛，用止血带扎住颈部，确定颈静脉。
⑵ 用2.5%碘酒和75%酒精消毒绵羊皮肤及采血者手指，持注射器，与颈静脉呈30度角，从头部向躯干方向进针，缓慢抽动针芯，观察是否进入静脉。一旦抽出血液，即固定注射器，抽取50～80ml血液，迅速注入含阿氏红细胞保存液的三角瓶内，立即混匀，4冰箱保存备用。
⑶ 取适量脱纤维羊血于离心管内，离心2000 rpm 5 min，吸弃上清及红细胞沉积物表面的白膜，加适量无菌生理盐水，毛细吸管吹吸几次以混匀，再离心弃上清，重复3次。
⑷ 最后一次离心2000 rpm 10min，根据红细胞压积，用生理盐水配成10%SRBC悬液。
⑸ 取少许10%红细胞悬液再稀释200倍，血球计数板计数后，配成2.0×108个细胞／ml。
2．免疫方法 免疫程序见表1-2。
表1—2 兔抗SRBC抗体制备免疫程序
| 免疫日程(d) | 1 | 3 | 5 | 7 | 9 | 12 | 15 | 20 |
| 注射剂量(ml) | 0.5 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | 2.5 | 2.0 | 2.0 | — |
| 注射途径 | 皮下 | 皮下 | 皮下 | 皮下 | 皮下 | 静脉 | 静脉 | 试血 |
3．收获溶血素 免疫注射第20天试血，溶血效价达1∶2000以上时，收获血清，用0.01%叠氮钠防腐，4℃保存备用。
三、兔抗人血清的制备
【原理】
以混合人血清免疫家兔，可获得兔抗人血清抗体。为使混合人血清能诱导家兔产生高效价特异性抗体，需添加佐剂。本试验采用弗氏完全佐剂，它可使抗原在体内缓慢释放，延长抗原在体内的停留时间，以获得较佳的免疫效果。
【材料】
1．健康家兔(体重2～2.5Kg)。
2．混合人血清。
3．弗氏完全佐剂。
4．无菌乳钵、滴管、注射器、9号针头、2.5%碘酒、75%酒精、无菌棉签等。
【方法】
1．混合人血清抗原的制备
选健康志愿者(学生)或献血员，静脉采血5ml；放试管中置室温下使其自然凝集，凝集后离心取上清约2.5ml。将多人(至少2～3人，最好10人以上)的血清混合，即为可用的人全血清。将人全血清用生理盐水作1∶2～1∶5稀释。
2．佐剂的制备
为了促进抗体产生，可在注射抗原的同时，加入一种辅助剂，这种辅助剂称为佐剂。佐剂一般是乳剂或悬液，当与水溶液抗原混合后形成一种油包水或水包油的乳状颗粒，这种颗粒延缓了抗原的释放，增加了局部刺激作用。抗原与佐剂同时应用，可促进抗原在淋巴组织中存留。佐剂本身可以有免疫原性，也可不具备免疫原性。常用的有免疫原性的佐剂有百日咳杆菌、革兰阴性杆菌的内毒素和抗酸杆菌(如结核分枝杆菌)等；非抗原性的佐剂有铝乳、磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、藻酸钙、聚核苷酸、胞壁肽等。应用最多的是福氏(Freund)佐剂，是用石蜡油、羊毛脂和卡介苗混合而成。
福氏佐剂分为不完全佐剂和完全佐剂，称取羊毛脂12g，加液体石蜡20ml，高压蒸汽灭菌后即成为弗氏不完全佐剂。在弗氏不完全佐剂内加入一定量的死卡介苗，成为弗氏完全佐剂。佐剂和抗原的比例为1∶1。
3．在弗氏完全佐剂中逐滴加入等体积的混合人血清，置于无菌乳钵中，朝一个方向研磨，每加1滴，都要研磨均匀后再加第2滴，直到乳钵内形成油包水的白色乳剂。将乳剂滴加于水中完全不散开时为合格。另一种方法是用两个5ml注射器，在接针头处用一尼龙管连通，一个注射器内是佐剂，另一注射器内为抗原。装好后来回推注，经多次混合逐渐变为乳剂。本法优点是无污染，节省抗原或佐剂，用此注射器可直接注射；缺点是不易乳化完全。乳化完全与否的鉴定方法是将一滴乳剂滴入水中，如立即散开，则未乳化好，如不散开漂在水面则为乳化完全。为了防止污染，有时在佐剂中加入抗生素。但抗生素有免疫抑制作用，如能注意无菌操作，就不必加入。
4．将乳剂抗原吸入不带针头的注射器内，接上针头后，尽量排除空气，用无菌大试管套住注射器，于4℃保存。
5．按表1-3所示免疫程序进行免疫注射。
表1-3 兔抗人血清制备的免疫程序
| 免疫日程(d) 1 7 14 21 28 |
| 注射剂量(ml) 0.5 0.5 1.2 2.4 — |
| 注射途径 后肢足蹼 淋巴结 背中皮内6点 背部皮下6点 试血 |
6．末次注射后7～10d试血。用免疫兔耳缘静脉血血清为抗体，用生理盐水作不同倍数稀释；用12倍稀释的混合人血清为抗原。按照沉淀反应要求，作琼脂双向扩散试验，以测定抗体效价。效价达1∶32以上，即可心脏采血，分离并收获抗血清。
7．作好标记，适量分装，—20℃冻存。
【注意事项】
1．选择动物时，动物种系与抗原来源的差异越远越好；动物应健康。处于青壮年时期。无特殊要求时最好为雄性。因有个体差异，故每种抗原最好免疫2～3只动物。
2．本实验每个步骤都必须严格执行无菌操作，防止抗原的污染。
3．菌液浓度可用比浊法调正。
4．从耳缘静脉抽血前，最好先用二甲苯涂擦耳缘背部，使充血便于进针。助手必须捏住兔耳根直至抽血完毕。
5．制备压积红细胞时，应无菌操作，避免剧烈振荡；试管应洗涤洁净，充分干燥，以免发生溶血。
6．全血清做抗原时要用混合血清，以避免个体差异带来的误差。
7．红细胞和细菌等颗粒性抗原比较容易诱导免疫应答，可直接用来免疫动物；而血清等可溶性抗原则需要加入免疫佐剂，充分乳化，否则不易免疫成功。
8．免疫时采用皮内多点注射易诱导免疫应答，提高血清的抗体效价。
9．免疫间隔时间无固定模式，但一般可溶性抗原首次免疫和第二次免疫以间隔10～20d为宜。
【思考题】
1．免疫血清制备的原理是什么?
2．试述免疫血清的应用。
3．为什么制备H抗原的伤寒菌液要用0.4%甲醛生理盐水处理?
4．制备SRBC悬液过程中，为何离心后要吸弃红细胞沉积物表面的白膜?
5．为什么要采用多份人血清混合来制备人血清抗原?
6．佐剂的种类有哪些?主要成分是什么?如何制备?有何用途?
7．为什么不同抗原免疫动物的途径和程序不同?
8．检测抗血清效价的方法有哪些?
实验二 沉淀反应
可溶性抗原如血清，毒素、细菌浸出液等和相应抗体相遇，当二者比例适当，并有电解质参与时，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应(precipitation)。参与沉淀反应的抗原称为沉淀原，抗体称为沉淀素。由于沉淀原多为可溶性物质，单位体积内所含的抗原量较多，与抗体结合的总面积大，为求得抗原与抗体的适当比例，操作时稀释抗原而不是稀释抗体，一般以出现沉淀现象的抗原最高稀释度作为沉淀反应效价。
沉淀反应是临床上常用的血清学试验之一。它的种类很多，有环状沉淀、琼脂扩散、免疫电泳等。利用可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂内进行扩散，当抗原与抗体相对应，二者比例适合时，就出现白色沉淀物。本试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂内进行操作。琼脂扩散试验可分为单向琼脂扩散试验与双向琼脂扩散试验等。
一、单向琼脂扩散试验
【原理】
是单向免疫扩散(single immunodiffusion)试验中的一种定量试验。将一定量的抗体混合于琼脂内，倾注于玻璃板上，凝固后，在琼脂层中打孔，再将抗原加入孔中。孔中抗原向四周扩散，在抗原与抗体比例合适处，呈现白色沉淀环。沉淀环的直径大小与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量可从标准曲线中求出。本试验主要用于检测血清中IgG、IgM、IgA和补体C3等的含量。
【材料】
1．1.5%盐水琼脂(生理盐水配制，琼脂含量1.5%)。
2．人IgG诊断血清。
3．待检标本 人血清。
4．全国统一人血清免疫球蛋白参考血清，系冻干正常人混合血清。
5．载玻片、微量加液器、打孔器(直径3mm)、注射针头、两脚规、直尺、半对数坐标纸等。
【方法】
1．将适宜稀释度的诊断血清与预先溶化的1.5%琼脂在56℃水浴中混匀，每块载玻片浇注3ml，制成免疫琼脂板。
2．用打孔器在免疫琼脂板上打孔，孔间距为1.2～1.5cm，挑出孔内琼脂。
3．稀释参考血清 每支干燥血清中加入蒸馏水0.5ml，待完全溶解后，用0.01M pH7.2～7.4PBS倍比稀释成1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160等5种浓度。
4．加样 用微量加液器取10μl各种不同浓度的参考血清，准确地加到琼脂板的各孔中，每种浓度加2个孔，用以制作标准曲线。测待检血清时，血清用PBS作1∶40稀释，每孔加10μl，每份标本加2个孔。
5．加样的琼脂板置湿盒内，经37℃24h后取出，测各孔沉淀环直径(图1-1)。
【结果】
1．取出琼脂板，即可见清晰的乳白色沉淀环。
2．标准曲线的绘制 以各种浓度标准抗原的沉淀环直径为横坐标，相应孔中IgG含量为纵坐标，在半对数纸上画出标准曲线。根据待检血清沉淀环的直径，查标准曲线，将查得的IgG含量乘以标本的稀释倍数，即为血清中IgG含量(图1-2)。
图1-1 单向琼脂扩散试验示意图
【注意事项】
1．制备免疫琼脂板时要掌握好温度。温度过高会破坏抗体活性；温度低于42℃则琼脂很快凝固，不能制板。
2．应从低浓度到高浓度的顺序加样，以免出现误差。
3．沉淀环的直径以毫米为单位测量。
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图1-2 单向扩散标准曲线示意图
二、双向琼脂扩散试验
【原理】
是双向免疫扩散(double immunodiffusion)试验中的一种。将可溶性抗原和抗体分别加入琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如果抗原和抗体相对应，则在两者比例适当处形成白色沉淀线。此试验可检测抗原或抗体的纯度，滴定抗体的效价以及用已知抗原(抗体)检测和分析未知抗体(抗原)。临床上常用于检测甲胎蛋白(AFP)，作为原发性肝癌的重要诊断指标。双向扩散需时较长(24h)，灵敏度不是很高。
【材料】
1．抗甲胎蛋白诊断血清。
2．脐带血清。
3．待检血清。
4．1%盐水琼脂，其他材料同单向扩散。
【方法】
1．制板 载玻片置于水平位，将3ml已溶化的盐水琼脂倒在玻片上，铺平，待冷。
2．打孔 用打孔器打孔，中央1孔，周围6孔，孔距6mm，排列方式如图1-3所示，将孔内琼脂挑出。
3．加样 用微量加液器往中央孔加入抗甲胎蛋白诊断血清；上下孔加脐带血清作阳性对照；其余4孔加待检血清，每孔量均为10μl，防止外溢。
4．将琼脂板放于湿盒内置37℃温箱中24h观察结果。
【结果】
1．若待检血清标本产生沉淀线，并与阳性对照所产生的沉淀线吻接成一线，则表示阳性。如无沉淀线或与阳性血清沉淀线交叉，则表示阴性(图1-4)。
图1-3 双向扩散法孔的大小及距离 图1-4 双向扩散法结果示意图
2．双向扩散时，在抗原和抗体的对应孔和临近孔之间，由于加入的抗原和抗体的成分不同，沉淀线的位置、数目与特征也有差别，这些都有助于分析抗原或抗体的成分。
⑴ 抗原与抗体的浓度相等，沉淀线在两孔之间呈直线形；抗体的浓度比抗原低，沉淀线靠近抗体一方；抗原浓度比抗体低，沉淀线靠近抗原一方(图1-5A)。
⑵ 在三角相对的排列孔中，若两抗原孔抗原相同，与同一相应抗体反应，两条沉淀线顶端相联(图1-5B)；若两抗原孔抗原不相同，与两种相应抗体反应，两条沉淀线相交(图1-5C)；若一抗原孔有两种不同的抗原，另一抗原孔只有其中一种抗原，抗体孔有两种相应的抗体，则形成的沉淀线既能连接，又出现一小支带(图1-5D)。
【注意事项】
1．孔中琼脂取出后要尽快加样，否则会有水分渗入孔中，影响加样量。
2．加样时动作要轻，尽量防止血清起泡；所加各样品不要溢出孔外，否则会影响沉淀线的形成。
3．扩散时间要适当。时间过短，沉淀线不能出现；时间过长，会使已形成的沉淀线解离或散开而出现假象。
4．加抗原和抗体时，应各用一只微量加液器，加样前后要分别用生理盐水清洗Tip头。
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三、对流免疫电泳
三、对流免疫电泳
【原理】
对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis)是把双向扩散和电泳技术结合在一起的方法。多数蛋白质抗原物质在碱性环境中由于羧基电离而带负电荷，在电泳时从负极向正极移动。抗体属球蛋白，所暴露的极性基团较少，在缓冲液中离解也少，而且分子量较大，移动较慢，在琼脂电渗作用下主要是顺着电子流方向由正极向负极移动，这样就使抗原和抗体定向对流，发生反应，并在短时间内出现肉眼可见的沉淀线，故可用于快速诊断。由于限制了双向扩散时抗原抗体的多向自由扩散，因而也提高了试验的敏感性。
【材料】
1．1%琼脂 用pH8.6巴比妥—盐酸缓冲液配制，冰箱保存备用。
2．电泳槽，其他试剂、检材及其他材料同双向扩散。
【方法】
1．制板 如前法溶化1%琼脂，浇注于载玻片，3ml／片，待冷。
2．打孔 要求孔距3mm，行距4～5mm，每张玻片可打数排孔。
3．加样 一侧孔加抗甲胎蛋白诊断血清，另一侧孔加待检标本和阳性对照血清，至完全充满孔内为止。
4．电泳 将加好的样品琼脂板置电泳槽上，抗原孔侧置阴极端，抗体孔侧置阳极端。琼脂板两端分别用2层滤纸与缓冲液相连。接通电源，控制电流在4mA／cm板宽，电压6～10V／cm板长，电泳约1h。
图1-6 对流免疫电泳示意图
【结果】
将玻片对着强光源观察，在待测抗原与抗体孔之间出现白色沉淀线，并与已知阳性对照比较(图1-6)。
【注意事项】
1．电泳时电流不宜过大，以免因发热使蛋白质变性或使凝胶断裂。
2．抗原与抗体的电极方向不能接反。
3．抗原抗体相对浓度要适当，抗原太浓太稀时都不易出现沉淀线。
4．电泳所需时间与孔间距离有关，距离越大，电泳时间越长。
四、免疫电泳
【原理】
免疫电泳试验(immunoelectrophoretictest)是将电泳和琼脂扩散相结合，用于分析抗原组成的一种定性方法，具有灵敏快速的优点。试验可分两个步骤：
1．电泳 将待检的可溶性物质在琼脂板上进行电泳分离。由于各种可溶性蛋白分子的大小、质量与所带电荷不同，在电场的作用下，其带电分子的运动速度也不相同，因此通过电流能够把混合物中的各种不同成分分离开来。
2．琼脂扩散 电泳后在琼脂槽中加入相应抗血清，然后置湿盒内让其进行扩散。当抗原与抗体相遇且比例适合时，可形成不溶性复合物，出现特异性沉淀线。根据沉淀线数量及位置可鉴定分析各种抗原成分及其性质。
【材料】
1．待检标本 正常人血清。
2．兔抗人血清。
3．1%离子琼脂 用0.05M、pH8.6的巴比妥缓冲液配制。
4．载玻片、直径3mm打孔器、0.2cm×0.6cm×6.0cm聚苯乙烯塑料条、微量加液器、电泳仪、注射器针头、吸管等。
【方法】
1．制板 载玻片放于水平台面上，将塑料条按图1-7放置于玻片上，吸取4ml热溶的1%琼脂于载玻片上，自然凝固后，取出塑料条，即成琼脂槽，再按图打孔，挑去孔中琼脂。
2．加样 用微量加液器往孔中加入标本，勿使溢出。
3．电泳 电压4V／cm，电泳1.5h。
4．扩散 琼脂槽内加入兔抗人血清，充满槽内，琼脂板置湿盒内37℃扩散24h，观察结果。
图1-7 免疫电泳琼脂板制作示意图
图1-8 免疫球蛋白的迁移范围
【结果】
在槽的两边出现相对称的弧形沉淀(图1-8)。
【注意事项】
1．操作时动作要轻巧，挖槽时要注意平行整齐，加入抗体时不要外溢。
2．电泳板扩散后，可直接观察，也可染色观察。无色标本要在黑色背景下，用斜射光观察。
3．搭桥应完全紧密接触，以免因电流不均而发生沉淀线歪曲。
五、火箭免疫电泳
【原理】
火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis)是在单向免疫扩散的基础上发展起来的一种技术。检测时将含有已知抗体的琼脂浇成琼脂板，打孔后加入待检样品和不同稀释度的标准抗原，经电泳后，与相应的抗体形成抗原抗体复合物，在两者比例适当的部位沉淀下来，所形成的沉淀峰形似火箭，故名。沉淀峰的高低与抗原的浓度成正比，因此可以对抗原进行定量测定。其敏感性较单向扩散要高，而且快速。本试验介绍人血清IgG的定量检测。
【材料】
1．抗原 待测人血清标本及已知的纯化人IgG样品。
2．抗体 兔抗人IgG血清。
3．1%琼脂 用0.05M pH8.6巴比妥缓冲液配制。
4．2.2mol/L甲醛液。
5．玻璃板(7×l0cm)、其他材料同免疫电泳。
【方法】
1．制板 先将1%琼脂糖凝胶于沸水浴中加热融化，保温于52℃水浴中，加入适量兔抗人IgG，使抗体浓度为0.75%～1%，迅速混匀，倾注于水平放置的清洁干燥的玻璃板上，待其冷却。
2．打孔 孔径3mm，孔间距5mm。
3．抗原的醛化
⑴ 先将血清标本和已知人IgG作不同浓度稀释。前者稀释为1∶40，后者稀释为1∶10、1∶20、1∶40、1∶80。
⑵ 分别取0.3ml样品和0.2ml 2.2mol/L甲醛液置于一列小试管内，混匀，置37℃温箱5min，进行醛化。
4．加样 于每孔内加入不同稀释度的标准抗原及待检抗原，每孔10μl。
5．电泳 抗原端接负极，电压3V／cm，电泳6～8h。
【结果】
1．琼脂板上出现不同高度的沉淀峰，形似火箭样（图1-9)。
2．制作标准曲线 以沉淀峰的高度作纵坐标，抗原浓度作横坐标，画
图1-9 火箭电泳示意图
出标准曲线（图1-9)。以测得的待检抗原峰的高度查标准曲线，即知待检
抗原浓度。
【注意事项】
1．电泳后可直接观察测量，也可干燥后染色观察。
2．低电压、低离子强度、较长电泳时间效果更好。
3．加样后应及时电泳。
【思考题】
1．试比较沉淀反应各种方法的原理和用途。
2．对流免疫电泳时，抗原和抗体为什么会向相反方向运动？
3．为什么不能用单向琼脂扩散试验来检测血清IgE含量？
实验三 凝集反应
颗粒性抗原在电解质参与下，与相应抗体结合形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集反应(agglutination)。颗粒性抗原指细菌、螺旋体、红细胞或带有抗原的颗粒载体等。凝集反应可分为直接凝集和间接凝集两大类。
一、 直接凝集反应
颗粒性抗原在电解质参与下直接与相应抗体结合出现的凝集反应。在操作上有玻片凝集和试管凝集两类。
（一)玻片凝集试验
【原理】用已知抗体(诊断血清)与待测抗原在玻片上的直接反应，为定性实验方法，常用于细菌种的鉴定和分型，也用于ABO血型的鉴定。
细菌的鉴定
【材料】
1．伤寒沙门菌、痢疾杆菌斜面8～24h培养物。
2．1∶20生理盐水稀释的伤寒沙门菌诊断血清。
３．生理盐水、接种环、载玻片等。
【方法】
1．将玻片分为3格，在第3格内加1滴生理盐水，第1、2格内各加1滴伤寒沙门菌诊断血清。
2．用灭菌后的接种环从斜面挑取伤寒沙门菌菌苔少许，置于第3格内磨匀，随即将环上余菌置于第1格内磨匀；接种环灭菌后挑取痢疾杆菌菌苔少许磨匀于第2格。
３．轻摇玻片，静置1～2min后室温下观察结果。
【结果】
第1格内形成白色小块凝集物，第2、3格内出现均匀浑浊现象。
【注意事项】
1．接种环每次取不同细菌培养物前后均要烧灼灭菌。
2．接种环须冷却才能取细菌培养物，取时勿将琼脂刮下。
3．载玻片应置于消毒缸内，切不可自行冲洗或乱丢；实验完毕后应在消毒液中泡手2～3min。
ABO血型鉴定
红细胞表面的A和(或)B抗原与相应的抗体结合后使红细胞凝集，借此判断待测的ABO血型。
【材料】
1．抗A血清、抗B血清。
2．采血计、小试管(内装1ml生理盐水)、玻片、牙签、一次性针头、酒精棉球等。
【方法】
1．红细胞悬液的制备 皮肤消毒后针刺手指尖或耳垂，采1～2滴血入装有1ml的生理盐水的小试管中，混匀，即成约2%～5%的红细胞悬液。
2．取洁净玻片一块，分为2格，分别标记A、B字样。将抗A血清、抗B血清各1滴加入A、B处。
3．取等体积的待测红细胞悬液(也可用全血)分别滴加入A、B处，用牙签的两头分别将红细胞悬液(或全血)与血清调匀，同时不断摇动玻片并观察红细胞凝集现象。
【结果】
红细胞凝集成块，周围液体澄清者为阳性(+)；红细胞仍呈悬液，无凝集者为阴性（–)。根据凝集情况，判断ABO血型(见表1-4))。
表1-4 ABO血型的鉴定
| 抗A血清 | 抗B血清 | 血 型 |
| + | – | A |
| – | + | B |
| + | + | AB |
| – | – | O |
【注意事项】
1．待测血样与抗血清调匀后，不要再用牙签搅动，以免影响大凝集块形成。
2．试验在低于10℃可出现冷凝集，造成假阳性。
3．对含较多自身冷凝集素的受检者，需用37℃生理盐水洗涤受检者的红细胞2～3次，再鉴定血型，防止误定为AB型。
（二)试管凝集试验
【原理】用已知诊断抗原与一系列稀释后的待测血清在试管内混合，观察每管的凝集程度，以检测抗体效价，为半定量试验方法。常用的有肥达试验和外斐试验，输血时也用于交叉配血定性试验。
【材料】
1．1∶10稀释的伤寒沙门菌“O”及“H”诊断血清、伤寒沙门菌“O”及“H”诊断菌液、生理盐水。
2．小试管、试管架、刻度吸管等。
【方法】
1．列两排试管，每排8支，依次编号，每管内加入生理盐水0.5ml。
2．用吸管吸取伤寒沙门菌“O”诊断血清0.5ml加于第一排的第1管，连续吹吸3次，充分混合后，吸取0.5ml加入第2管，同法混匀后又吸取0.5ml加入第3管，依此类推，连续稀释到第7管，最后从第7管吸出0.5ml弃去，第8管为生理盐水对照管。
3．同法稀释第2排的伤寒沙门菌“Ｈ”诊断血清。
4．吸取伤寒沙门菌“O”菌液，于第一排各管内加0.5ml(顺序从第8管开始往第1管加)，同法于第二排各管内加伤寒沙门菌“H”菌液0.5ml。
5．各管摇匀后，置室温(或37℃)24h后观察结果。操作步骤见表1-5。
表1-5 试管凝集反应操作步骤 单位：ml
| 管 号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | ||
| 生理盐水 |
| 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
 0.5 | ||
| 1/10伤寒血清 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |||
| 伤寒菌液 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | ||
| 血清终稀释度 | 1:40 | 1:80 | 1:160 | 1:320 | 1:640 | 1:1280 | 1:2560 | — | ||
| 室温(或37℃)24h | ||||||||||
| 结 果 |
【结果】
凝集程度
++++ 液体清澈，管底形成大片凝集物，表明细菌全部被凝集。
+++ 液体轻度浑浊，管底凝集物较少，表明细菌大部分被凝集。
++ 液体半澄清，管底有较多细小凝集物，表明细菌部分被凝集。
+ 液体浑浊，管底凝集物少，表明细菌少部分被凝集。
– 液体浑浊，管底有圆点状细菌的沉积，边缘整齐，表明细菌无凝集。
以产生明显可见凝集现象(++)时血清的最高稀释度作为血清中抗体的效价。
【注意事项】
1．混匀血清时不能产生气泡，以免影响稀释血清量的吸取。
2．观察结果时应先看第8管(对照管)，该管应无凝集现象。
3．注意第1和第2排凝集现象的区别，“O”菌液凝集物为致密颗粒状，不易摇起，“H” 菌液凝集物为疏松棉絮状，轻摇易浮起。
4．前带现象 抗原抗体反应时必须有适当的比例才能出现肉眼可见的凝集物，若抗原或抗体过多，均不形成肉眼可见的凝集物，此为前带现象。在凝集反应中通常稀释血清抗体使其与抗原保持适当比例。
【思考题】
1．直接凝集反应有哪几种？各有何用途？
2．什么是抗体的效价？为什么效价可以表示血清中抗体的含量？
3．凝集反应的原理和沉淀反应有何不同？
4．做完伤寒、痢疾杆菌鉴定后的玻片为什么不能直接用自来水冲洗？
二、间接凝集反应
将可溶性抗原(或抗体)先吸附于适当大小颗粒性载体的表面，然后与相应抗体(或抗原)作用，使载体被动凝集为肉眼可见的凝集物，称间接凝集反应或被动凝集反应。其检测可溶性抗原的敏感性高于沉淀反应。
(一) (正向)间接凝集反应
【原理】
用可溶性抗原致敏载体以检测相应抗体。常用的载体有红细胞、乳胶、活性炭等，因而根据载体的不同可分为间接血凝反应、间接乳凝反应、间接炭凝反应等。临床上常用于HBsAb、RF、梅毒反应素等抗体的检测。本试验以检测梅毒反应素为例。受梅毒螺旋体感染后，机体可产生一种非特异性的抗体—反应素，该抗体能与牛肌心磷脂抗原发生交叉反应。将处理后的可溶性牛心肌磷脂抗原吸附到活性炭载体表面致敏以检测反应素，称为RPR（rapid plasmareagin，快速血浆反应素)试验，常用于梅毒的初筛。
【材料】
1．RPR试剂。
2．待测血清、冻干阳性对照血清(用时溶于0.2ml生理盐水)。
3．RPR试验专用卡片。
4．9号无斜面针头(滴加RPR试剂用)。
【方法】
1．取阳性对照血清、待测血清(不需灭活)各1滴约50μl，分别均匀涂满整个卡片圈内。
2．将RPR抗原试剂轻轻摇匀，拧开盖，套上9号针头，垂直向阳性和待测血清卡圈内加1滴(约17μl)抗原。
3．用转动器或手摇卡片8min后在明亮光线下肉眼观察结果。
4．如做半定量试验，可将待测血清做2倍系列稀释，再按上述定性方法进行试验。
【结果】
1．阳性反应 可见中等或大的黑色凝集块。
2．弱阳性反应 可见散在的小黑色凝集块。
3．阴性反应 无颗粒凝集，或仅见有粗糙炭颗粒集中中央。
【注意事项】
1．RPR抗原试剂从4℃冰箱中取出后先要室温下预温；试验应在23～29℃室温中进行，排除因室温不符可能出现的假阳性。
2．摇完卡片后应在3min内观察结果，因随时间延长反应性可逐渐增强。
3．使用专用针头时应采用垂直位置，使每滴大小均匀一致。
4．试剂卡片为一次性使用。
5．初筛阳性的结果，应进一步做梅毒确诊试验。
(二) 反向间接凝集反应
【原理】
用抗体致敏载体以检测相应可溶性抗原。根据载体的不同可分为反向间接血凝反应、反向间接乳凝反应等。临床上常用于HBsAg、AFP等可溶性抗原检测。将绵羊红细胞或“O”型人红细胞用醛类固定(称为醛化，可使红细胞易于吸附蛋白质类抗原或抗体，可长期保存而不溶血)，再将纯化的抗体吸附于醛化的红细胞上而致敏，当与可溶性抗原结合后，使红细胞被动凝集即血凝。本试验以AFP的检测为例，将AFP抗体吸附于红细胞来检测AFP可溶性抗原，临床上常作为原发性肝细胞癌的辅助诊断。
【材料】
1．已经稀释的AFP诊断血球(吸附抗AFP而致敏的红细胞，冻干制剂每支加2ml生理盐水溶解后充分摇匀即可)。
2．分别稀释为1∶10、1∶100、1∶1000的阳性血清、阴性血清和待测血清。
3．微量血凝板、试管、吸管、生理盐水。
【方法】
1．在微量血凝板上编号，用吸管吸取三www.lindalemus.com/hushi/种不同稀释度的待测血清分别加入第一排的第1、2、3孔内，每孔加1滴。同法取不同稀释度的阳性血清、阴性血清分别加入第二、三排的1、2、3孔，第四排中的第1孔，加入生理盐水1滴(25μl)（图1-10)。
2．于上述各孔中分别加入稀释的致敏血球1滴，充分摇匀后置37℃温箱中，30min后观察结果。
【结果】
阴性 血球沉于孔底呈致密圆点状；
阳性 孔内半数以上血球均匀平铺孔底，呈中等以上面积的均匀薄膜；
阴性血清及生理盐水对照 血球全部下沉，集中在孔底成致密圆点状；
阳性血清对照 血球均匀平铺孔底成薄膜状。
图1-10 反向间接血凝检测AFP
【注意事项】
1．所有用具(血凝板、试管、滴管)须高度洁净；待测血样及各种溶液须避免含AFP材料污染或杂菌污染。
2．诊断血球每次使用前必须充分摇匀。
3．每次试验均应设阳性、阴性和空白对照。
(三)间接凝集抑制反应
【原理】
可溶性抗原致敏的颗粒与相应抗体结合后可使颗粒凝集，但若此抗体先与待测的可溶性抗原结合，再加入抗原致敏的颗粒，则抗体不能再与致敏颗粒表面的可溶性抗原结合，此为间接凝集抑制反应，用于可溶性抗原的检测。临床上常以乳胶为载体做妊娠诊断高级职称考试网试验检测绒毛膜促性腺激素(HCG)。
【材料】
1．HCG致敏的聚苯乙烯乳胶颗粒、兔抗人HCG免疫血清、待测尿、孕妇尿(HCG阳性)、正常尿。
2．载玻片、滴管、牙签等。
【方法】
1．将玻片分为3格，于第1、2、3格内分别加入1滴(50μl)待测尿、孕妇尿、正常尿。
2．于每格内加入兔抗人HCG免疫血清各1滴，轻轻摇动或用牙签搅匀，使充分混匀，静置1～2min。
3．于每格内加入HCG致敏乳胶各1滴，轻轻摇动或用牙签搅匀，静置3～5min后观察结果。
【结果】
孕妇(HCG阳性)尿格内呈均匀浑浊乳液状；正常尿内出现均匀白色细小颗粒状凝集物；待测尿格若为乳液状，则妊娠试验为阳性，若出现细小凝集物，则为阴性。
【注意事项】
1．待测尿以晨尿最好(HCG含量最高)，及时送检或置冰箱冷藏，冷藏超过24h则置—20℃冻存，使用前先经37℃水浴并充分混匀，标本中若含红细胞或较多蛋白和细菌污染则不宜使用。
2．应在15℃以上进行试验。如果温度过低，可延长观测时间1～2min。
3．滴加尿标本应与抗血清之液滴大小一致，二者摇匀后再滴加乳胶。滴加时切勿含有气泡，否则影响结果。
(四)协同凝集试验
【原理】
葡萄球菌A蛋白(SPA)是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种表面抗原，能与人或多种哺乳动物的IgG Fc段非特异性结合而不影响Fab段与相应抗原的特异性结合，使葡萄球菌被动凝集，其本质是一种间接凝集反应，敏感性高，常用于病毒、细菌毒素等可溶性抗原检测。
【材料】
1．金黄色葡萄球菌Cowan I株18～24h培养液、伤寒沙门菌O菌液、伤寒沙门菌O抗原的抗血清(56℃30min灭活)、pH7.2 0.2%甲醛缓冲盐水、生理盐水。
2．离心机、水浴箱、无菌滴管、吸管及试管、牙签、玻片等。
【方法】
1．制备致敏菌液 用pH7.2 0.2%甲醛缓冲盐水将金黄色葡萄球菌培养液(经80℃10min灭活)稀释成10%的悬液，取此液1.0ml，加0.1ml伤寒沙门菌O抗原的抗血清，充分混匀后37℃水浴30min，3000rpm离心20min。弃去上清液，再用甲醛缓冲液将沉淀物洗涤一次，弃去上清，将沉淀物作适当稀释即成抗体致敏的金葡菌液。
2．将玻片分为三格，编号1、2、3，于第1、3格内各加1滴伤寒沙门菌O菌液，第2格内加1滴生理盐水。
3．于第1、2格各加1滴抗体致敏的金葡菌液，第３格内加未致敏的金葡菌液1滴。
4．用牙签混匀，1～5min内观察结果。
【结果】
第1格内形成白色凝集颗粒，第2、3格内液体浑浊。
【注意事项】
1．协同凝集试验的特异性和反应的强弱取决于致敏SPA菌液的免疫血清，因此要选择特异性强和效价高的制剂。
2．SPA对不同种属的IgG的亲和力不同，在制备致敏SPA菌液时要选择适当动物的抗血清。
3．每次试验应同时设阳性和阴性对照；同时还要设未致敏的金葡菌液对照，以排除菌体的自凝现象。
【思考题】
1．正向间接凝集试验和反向间接凝集试验的原理是什么？
2．间接凝集反应有哪几种？各有何用途？
实验四 单克隆抗体的制备
借助物理或化学手段，将二个或二个以上不同特性的细胞融合在一起，组成一个异型核(heterokaryous)细胞，新形成核细胞称为杂交细胞。如果二个细胞中有一个为瘤细胞，则融合的细胞称为杂交瘤细胞。杂交瘤细胞具有两亲本细胞的基因，并可表达亲本细胞特性。由“免疫B细胞-浆细胞-瘤细胞”融合形成的杂交瘤细胞库可产生单一、特异性、纯化的抗体。该融合细胞是经过反复克隆而挑选出来的，由该克隆细胞产生的抗体称为单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)。一种McAb在分子结构、氨基酸序列以及特异性等方面都是一致的，因此得到了广泛的应用。
【原理】
利用杂交瘤技术制备McAb的基本原理是：⑴淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种淋巴细胞克隆只产生一种抗体；⑵细胞融合技术所产生的杂交瘤细胞可以保持亲代细胞双方的特性；⑶利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞，并进行克隆化，然后大量培养增殖，制备所需的McAb。
应用能够长期生长的骨髓瘤细胞(纯系小鼠腹水瘤型浆细胞，如X63、SP2／0等)和经抗原致敏，且能分泌某种抗体的淋巴细胞(免疫动物脾细胞)进行融合。该种融合的杂种细胞一方面具有骨髓瘤细胞在体外连续传代的能力，另一方面又继承了免疫细胞能大量地合成、分泌特异性抗体的功能。这种融合的杂种细胞称为淋巴细胞杂交瘤。
【材料】
1．试剂 优质小牛(或胎牛)血清、DMEM培养液、HT适应性培养基、HAT选择性培养基、50%PEG。
2．实验动物 6～8周龄雌性BALB／c小鼠。
3．细胞 小鼠骨髓瘤细胞一Sp2／0细胞。
4．抗原 病毒、细胞或可溶性抗原。
5．仪器 CO２细胞培养箱、超净工作台(或无菌间)、倒置显微镜、24孔塑料细胞培养板、50ml塑料离心管等。
【方法】
1．杂交瘤细胞株的建立
⑴ 免疫BALB／c小鼠
病毒抗原 50ug抗原(蛋白)与等量佐剂乳化后，腹腔或皮下多点注射，间隔4～5周注射第二次，1周后注射第三次。最后以同样剂量的抗原，经尾静脉加强免疫。3d后取脾。
可溶性抗原 100ug与2×108灭活的百日咳杆菌混合，腹腔注射4～6周后，用100ug～200ug抗原再免疫一次，3d后取脾。
细胞抗原 2×107细胞抗原鼠腹腔注射，2～3周后重复，共注射三次，3d喉后取脾。
⑵ 饲养细胞的制备(融合前一天)
在体外细胞培养中，单个或少数分散的细胞不易存活与繁殖，必须加入其他活细胞才易存活与繁殖，这种加入的其他细胞称为饲养细胞。通常多用小鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。
取正常BALB／c小鼠1～2只，拉颈处死，消毒后用小剪刀在小鼠腹部腹中线剪一横口，将皮肤向两边撕开，暴露出腹部。然后将5ml DMEM液注入腹腔诱聚腹腔细胞，用原来的注射器将注入的液体吸回，放人50ml离心管中，离心1000rpm 10min，弃上清，加完全DMEM液(约5×106／ml细胞数)，按每孔0.1m1分装到96孔培养板。置37℃含5%CO２养箱过夜使用。
⑶ 骨髓瘤细胞悬液的制备
常用的骨髓瘤细胞系有2个，即NS一1和SP2／0。Sp2／0细胞本身不分泌任何免疫球蛋白或其组分，为应用最多的骨髓瘤细胞系。
用含20%牛血清的DMEM扩大培养Sp2／0细胞。融合的当天在倒置显微镜下挑选大小均匀、透亮、轮廓清楚、规则的瘤细胞，轻轻吹下，收集于50ml离心管中，离心1000rpm 10min，用DMEM液悬浮细胞沉淀。台盼蓝染色检
查活细胞数应大于95%，置37℃备用。
⑷ 免疫小鼠脾细胞悬液的制备(融合当天)
取加强免疫3d后的BALB／c小鼠1只，拉颈处死，消毒后无菌取出脾脏，放入平皿内的200目钢网上，加入10ml DMEM液，用注射器芯将脾细胞轻轻挤压过网，即得脾细胞悬液，然后离心1000rpm 10min，弃上清，用DMEM液悬浮沉淀。细胞计数后冰浴备用。
⑸ 细胞融合
选分子量为4000的PEG作融合剂，浓度为50%，过高浓度的PEG对细胞有毒性。在PEG的作用下，先引起细胞膜的融合，然后是核的融合。按细胞匹配法(2∶1～10∶1)，取1×10８脾细胞与1×10７骨髓瘤细胞混合于50ml离心管中，离心1000rpm 10min，倾去上清，轻弹管壁，使沉淀物混匀如糊状；在37℃水浴中加入0.7ml 50%PEG促进融合，边加边旋转，使细胞保持均匀状态，1min内加完；静置90s。立即在3～4min内缓慢加入20ml DMEM液以终止反应。室温离心800～1000 rpm10min，弃上清，于融合细胞沉淀管内加入含HAT的完全DMEM培养液20ml；按每孔0.1m1分装入备有饲养细胞的96孔细胞培养板内。置37℃，5%CO２培养箱培养。
⑹ 融合细胞培养及观察
融合后，每3～5d用HAT选择培养液换液一次，连续2周；同时观察并记
录杂交瘤细胞是否出现。2周后，改用HT适应性培养液。待杂交瘤克隆长至
1／4～1／5视野时，进行阳性克隆的筛选。
图1-11 单克隆抗体制备的技术流程
2．杂交瘤细胞的筛选及鉴定
⑴ 阳性杂交瘤细胞株初选 杂交瘤细胞培养物的测定方法，可根据抗原的性质和需要的灵敏度来选择。如免疫荧光、酶标记免疫实验、放免测定、
血凝试验、溶血空斑试验、抗体结合细胞制动试验等。
⑵ 阳性杂交瘤细胞克隆化 克隆化就是指通过适当的方法将所需单个细胞分离出来进行培养。获得单个细胞培养的这种方法，通常称为克隆化。细胞通过克隆化可获得单克隆细胞系，也可防止竞争淘汰和防止外来干扰。
现在已建立起来的克隆化方法有多种：显微挑选法、琼脂空斑法、琼脂分散法、有限稀释法等。有限稀释法的操作方法如下：其最大优点是克隆率特别高，几乎达100%。分三步进行：①制备饲养细胞(方法同前)；②杂交瘤细胞计数；③连续稀释：将杂交瘤细胞稀释到5～10个细胞／ml，再分别装入备有饲养细胞的96孔板，每孔0.1ml(约1个杂种细胞)。培养和观察同上。
⑶ 单克隆抗体Ig亚类鉴定 以分泌抗体的杂交瘤细胞培养上清为抗原，与羊抗鼠Ig及Ig亚类分别作琼脂双扩散，观察有无沉淀线出现。
3．单克隆抗体的大量制备及纯化
杂交瘤细胞体外培养可得到的抗体效率有限，不能超过特定的细胞浓度，每天还要调换培养液，用体内杂交瘤细胞繁殖可消除这些限制。
⑴ 单克隆抗体的制备 将0.5ml降植烷(或液体石蜡)注射每只BALB／c系小鼠(腹腔注射)，7～10d后腹腔注射107分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。经2～3周小鼠可产生实体瘤或腹水瘤，腹水增多。这时抽出腹水，置4℃离心3000 rpm 10min，取上清检测抗体效价，分装，低温保存。
⑵ 单克隆抗体的纯化 虽然单克隆细胞培养物或腹水中具有高滴度抗体，对某些研究工作亦足够纯，但其中仍有许多无关蛋白，它们来自培养基、宿主或克隆化细胞本身。因此有必要进一步分离和纯化。常用的方法有硫酸铵沉淀法和免疫亲和层析法。
【注意事项】
1．整个实验过程均应严格无菌操作。
2．制备饲养细胞时，注入和抽取腹腔液时，避开网膜，动作要轻，以免损伤肝、脾。
3．PEG的量为0.7ml，加终止剂的速度要均匀。
4．McAb筛选前，应提前选择稳定的方法，固定检测系统及试剂。
5．换液时避免细胞克隆打散。
【思考题】
1．McAb制备的原理是什么?McAb有何特点?
2．如何大量制备和纯化McAb?
0.5