生理学实验指导-第二篇:第十五章

第十五章 人类疾病动物模型复制

第一节  概述

由于人类疾病的复杂性，医学研究中必须对疾病过程进行各种观察、分析和实验。这些工作大多不可能在人体上进行，必须借助于适当的动物及其器官、组织和细胞进行研究。供医学研究用的这些动物具有与所研究的人类疾病相似的特点，故称之为人类疾病动物模型(animal models of human diseases)。人类疾病动物模型通常可以通过人工诱发，或选择具有相应特点的自然动物而获得。

人类疾病动物模型通常依照研究目的而设计，不同的研究选用的动物模型可有很大差别，所以人类疾病动物模型很多，也很复杂。许多人类疾病的动物模型可以自然获得，即利用动物自发性的遗传特性或通过育种手段培育遗传特性建立而成，如裸鼠、肥胖症小鼠、自发性高血压鼠、自发性高胆固醇血症鼠等。

更多的人类疾病实验动物模型是用人工方法，将致病因素作用于动物，诱发动物特定器官、组织、细胞或全身的损害，造成与所研究的人类疾病相似的机能、代谢和形态学的改变。可用于诱发疾病模型的方法和因素很多，包括物理因素、化学因素、微生物因素以及基因工程技术等。

近年随着生物技术的发展，越来越多地应用生物工程技术方法制作动物模型，包括利用动物卵或胚胎移植、胚胎嵌合、细胞核移植、转基因或基因敲除和克隆等技术制作人类疾病的动物模型。

复制的人类疾病动物模型是否能真正地、客观地反映人类疾病是能否作为研究对象而用于医学研究的关键。但动物与人类之间存在着很大的差异，任何一种人类疾病的动物模型不可能与人类疾病完全相同，而且影响因素很多，所以在选择和设计动物模型时要尽可能力求全面周密，在分析实验结果时要充分考虑动物模型的局限性。

复制人类疾病动物模型有三点最基本的要求：一是复制模型选用的动物应尽可能接近人类，建立的模型必须尽可能地与所研究的人类疾病有相同的或相近的机能、代谢和形态学变化特点，病变发生机理应尽量与相应的人类疾病相同；二是选用的方法要保证疾病动物模型复制有较高的成功率，具有较好的可重复性和一定的稳定性，以供他人应用和验证；三是复制成功的动物模型应有明确而可靠的测量或观察的指标，以供判断病变的轻重程度和病程的缓急。

应该强调指出的是，动物模型的设计和选择都要适合于研究的目的，即便研究同一疾病，但因研究的发病环节不同也不可套用同一动物模型。

本章节选择性的介绍几种严重威胁人类生命的疾病和综合征的动物模型复制方法，供学生在探索性实验阶段参考。

第二节  动脉粥样硬化模型

动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS)性疾病是目前危害人类健康的“头号杀手”，动脉粥样硬化斑块的形成最常见于大、中动脉。动脉粥样硬化斑块的发生发展过程大致如下：由于血浆脂质水平的升高或同时有其他危险因子的存在，使动脉内皮发生了某种损伤性变化，使血浆脂质易于通过动脉内膜进入内膜下间隙并沉积。同时血流中的单核细胞易与内皮细胞发生粘附，并通过内皮细胞间隙跨过内皮进入内皮下，摄取大量脂质而转化成泡沫细胞，形成脂质条纹，随后血管平滑肌细胞向内膜方向迁移，并摄入脂质和合成大量细胞间质，导致动脉粥样硬化斑块形成。

AS研究领域中经常使用动物模型作为实验对象，获得大量实验结果，大大促进了人们对AS的认识。本节主要介绍实验性动脉粥样硬化动物模型和泡沫细胞模型的复制方法。

一、动脉粥样硬化动物模型的复制

（一)家兔

家兔是复制动脉粥样硬化模型最常用的动物，它对外源性胆固醇的吸收率高，可达75～95%，静脉注入胆固醇后高脂血症可持续3～4天。只要给兔含胆固醇较高的饲料，不必附加其它因素，经3～4月即可形成明显的动脉粥样硬化病变，而且与人体发生的病变相似，取血检查也较方便。

通常选用体重2kg左右的新西兰白兔或日本大耳白兔，每天喂服基础饲料加胆固醇0.3g，4个月后肉眼可见主动脉粥样硬化病变；若每天胆固醇剂量增至0.5g，3个月后可出现病变；若增至每天1g，可缩为2个月。在基础饲料中加入15%蛋黄粉、0.5%胆固醇和5%猪油，经3周后，将饲料中胆固醇减去，再喂3周，可使主动脉病变发生率达100%，血清胆固醇可增高至2000mg%。

促进病变形成的方法：

1．在高脂饲料中还可加入甲基硫氧嘧啶、丙基硫氧嘧啶、甲亢平、苯丙胺、维生素D、烟碱或蔗糖等；

2．预先用Fogarty球囊导管插入主动脉，造成内皮细胞剥脱的浅表损伤，再喂高脂饲料；

3．静脉滴注去甲肾上腺素引起血管壁中层弹性纤维拉长、劈裂或断裂；

4．皮下注射同型半胱氨酸硫代内脂（dl-homocysteinethiolactone)可明显促进动脉粥样硬化病变。

（二)其他动物

除田鼠和地鼠外，一般温血动物只要用适当的方法，都能形成动脉粥样硬化的斑块病变。已经用于复制动脉粥样硬化模型的动物除兔以外，还有鸡 、鸽 、猴 、猪等。 具体选取哪种动物来复制模型，需要根据实验目的及观察指标、实验时间等。

（三)动脉粥样硬化动物模型的鉴定

处死动物，选取观测的动脉，剪开剖面，用苏丹Ⅳ或者油红O染色，使病变面积呈现红色，用计算机图像处理系统或求积仪计算病变面积百分比。根据病变面积百分比进行病变分级，判断粥样硬化病变的程度。按病变面积百分比分级标准见表15-1。

  表15-1 按病变面积百分比分级标准

二、泡沫细胞模型的复制

巨噬细胞和增殖移行的中膜平滑肌细胞表面存在有清道夫受体（scavenger receptor)，能无反馈地摄取大量修饰变性的低密度脂蛋白（LDL)，特别是氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL)，使细胞内充满大量脂滴，呈泡沫状，称为泡沫细胞。泡沫细胞是动脉粥样硬化病变重要的特征性细胞，所以常用Ox-LDL与巨噬细胞或血管平滑细胞共孵育，形成泡沫细胞，作为动脉粥样硬化研究的实验模型。

（一)LDL的制备和氧化修饰

1．LDL的制备：见有关专业书籍。

2．Ox-LDL的制备（LDL的氧化修饰)：

在氧化前，LDL先用无EDTA的PBS液透析24小时，以除去EDTA；再将LDL在含10μmol/LCuSO₄的PBS中，于37℃氧化12小时；然后于4℃，在含100mg/LEDTA的PBS中透析，每8小时换液一次，透析24小时；最后过滤除菌，4℃保存。

（二)巨噬细胞的培养

细胞培养是把从人体或动物体上取得的组织用机械或消化的方法分散成单个的细胞悬液，然后在模拟体内生理环境等特定的体外条件下，进行孵育培养，使之生存并生长。泡沫细胞模型的细胞来源于单核巨噬细胞或血管壁平滑肌细胞。

通常多用小鼠腹腔巨噬细胞与OxLDL共孵育以培养泡沫细胞。步骤如下：选取8周龄、无感染的小鼠，眼球放血或颈椎脱位致死；用70%酒精消毒腹部皮肤，在无菌条件下，用镊子提起腹部皮肤剪去约3～5厘米长的皮肤，暴露去皮的腹壁；再用注射器将3～4ml无血清的1640培养液注入腹腔，轻揉片刻后抽出腹腔液；将其注入离心管，于4℃，1000rpm/min离心10分钟，去上清液，加同样培养液调整细胞数为1～5×10⁶/ml。若需要的细胞数多，可将数只小鼠的细胞收集在一起。而豚鼠、家兔腹腔巨噬细胞的取得，需在数日前于腹腔注射石蜡油诱发巨噬细胞在腹腔聚集。

由于巨噬细胞有很强黏附能力，要分离它最常用的方法是贴壁法，即将含有巨噬细胞的悬液加到盖玻片上、培养瓶或培养板内，于37℃培养30～60分钟，巨噬细胞开始贴壁，此时用Hanks液冲洗5次，以洗去未贴壁的其他细胞，最后得到较纯的巨噬细胞，加含10%小牛血清的1640培养液，置37℃培养箱。由于巨噬细胞是终末细胞，故不能长期传代培养。

血管平滑肌细胞的培养可参阅有关书籍。

培养的腹腔巨噬细胞或血管平滑肌细胞传至3～5代，培养瓶换培养液后，加入已制备好的Ox-LDL，培养48～72小时，观察细胞形态的改变及测定细胞内胆固醇的含量。

（三)细胞形态学的观察

将贴壁于盖玻片的细胞取出，以PBS液冲洗3次，于10%甲醛中固定24小时，用油红O方法染色。在倒置显微镜下观察，并以10×100倍彩色照相。

（四)细胞内胆固醇（Ch)和胆固醇酯(ChE)的测定

用0.25%胰酶消化1min，收集细胞，以1000rpm/min离心10min，弃去上清液，用PBS液冲洗一次，加入异丙醇0.5ml，在超声波清洗器上震动10s/min×3次，再以1000rpm/min离心15min。吸取上清液用TC试剂药盒及FC试剂药盒分别测定其总胆固醇（TC)和游离胆固醇（FC)，并将其离心沉淀物用0.1mol/LNaOH 0.5ml裂解细胞，用Lowry法测定细胞蛋白含量。细胞内的胆固醇含量以TC/g细胞蛋白和FC/g细胞蛋白表示，两者之差即为ChE/g细胞蛋白含量。

 （杨永宗)

第三节 糖尿病动物模型

糖尿病（diabetes mellitus)是一种古老的疾病，关于糖尿病的记载，最先见于文明古国中国、印度、埃及等国家，约有一千余年至数千年的历史。近年来糖尿病（diabetesmellitus)的研究进展迅速，虽然许多新的发现和成就充实了对本病的认识，但病因及发病机理方面仍未完全阐明。

糖尿病以持续高血糖为基本生化特征，其病因目前尚无定论。糖尿病不是单一原因与发病机制引起的疾病，而是由不同原因引起的体内胰岛素缺乏或胰岛素效应降低，临床以糖代谢紊乱为主的一组代谢性疾病的总称。按WHO1985年的分型标准，它分为：胰岛素依赖型（IDDM，Ⅰ型)、胰岛素非依赖型（NIDDM，Ⅱ型)、营养不良性糖尿病（Ⅲ型)和其它类型。IDDM患者的基础及葡萄糖负荷后胰岛素分泌均呈现低水平状态，反映了胰岛素的完全缺如或严重缺乏。NIDDM患者胰岛素分泌功能障碍较轻，表现在第一时相缺如及分泌高峰后移，该类患者基础胰岛素分泌常增高或正常，而胰岛对葡萄糖刺激的反应减弱，在葡萄糖负荷后胰岛素分泌水平较相应体重为低。一般认为IDDM和NIDDM的发病与自身免疫、遗传、病毒感染、胰岛素抵抗等有关，继发性糖尿病的病因多数较清楚。在这些因素的作用下，发生了胰岛素的缺乏和作用减低，从而引起体内代谢紊乱，导致血糖升高。

对糖尿病研究的重要方法之一是复制糖尿病动物模型，目前能够用来复制糖尿病模型的动物有地鼠（Carpenter,1970)、大鼠（Maner,1972)、小鼠（Butler,1972)、豚鼠（Munger,1973)、狗（Kramer,1980)、猫（Johnaon,1973)、兔（Roth,1980)、猪（Lang,1977)和灵长类（Howard,1980)。复制糖尿病动物模型有多种，按产生原因分为：（1)自发性动物模型（spontaneousanimal model)，指实验动物在自然条件下自然产生的、或由于基因突变而出现的类似人类疾病的动物疾病；（2)诱发性动物模型（experimentalartificial or induced animal model)，指通过物理、化学、生物等致病手段，人为造成动物组织、器官或全身形成类似人类的疾病，动物在功能、代谢、形态结构等方面有相应的改变。 

一、动物模自发性型

（一)小鼠

KK糖尿病小鼠是1941年K.Kondo用日本商人的kasukabe小鼠原种群培育而成的，属先天性遗传缺陷小鼠。该动物对胰岛素不敏感、对葡萄糖耐性小、糖尿病发病率高、老年动物偶见肥胖。

（二)大鼠

BB Wistar大鼠是一种典型自发遗传IDDM型糖尿病动物模型，85日龄出现症状，发病率为50％～70％，临床表现为多饮、多食、糖尿病、高血压、酮症，病鼠胰岛内β-细胞大量破坏，病理学改变为胰岛炎，伴有外周神经系统严重病变、睾丸萎缩、甲状腺炎、胃溃疡、恶性淋巴瘤等。该型与人类发病年龄较早的少年型糖尿病极为相似。

NIH肥胖大鼠品系（SHR/N-cp)是新培育的一种用于肥胖症和糖尿病研究的遗传动物模型。其特征主要是脂肪聚集层，脂肪细胞体积和数量增加并有损伤发热作用。雄性肥胖大鼠有轻度高血压，当饲喂高糖饮食时，表现出与人NIDDM型糖尿病相似的代谢改变，包括胰岛素分泌过多、高血脂，不耐葡萄糖和糖尿病。

（三)地鼠

中国地鼠（黑线仓鼠)有50％自发性产生糖尿病，属多基因遗传，病鼠耐糖曲线似人类NIDDM糖尿病。

（四)新西兰白兔

美国退伍军人管理局医疗中心于1969年发现一只6～12月龄的雌性新西兰白兔有烦渴和多尿现象，血糖和尿糖均明显增高，确诊为糖尿病。经连续几代近亲繁殖，遂形成具有自发性糖尿病的一个品系。其中19％为显著高血糖及糖尿的显性糖尿病兔，另外27％的兔空腹血糖正常但处理静脉注射葡萄糖能力异常。这两种兔的其他一些特征包括烦渴、多尿、贪食、胰岛素释放严重受损及胰岛β细胞颗粒增多。这些兔不肥胖，且有轻度酮症酸中毒。病理学发现，糖尿病兔的特殊损害局限在胰岛β细胞及肾脏。本动物模型与人类的IDDM或青少年中成年发作型糖尿病极为相似。

二、 诱发性动物模型

诱发性糖尿病动物模型的复制方法有多种，包括手术、化学物质损伤、微生物感染、营养源性诱导等等。

（一)手术

自从德国的Von Mening将犬作胰腺全切除术造成糖尿病后，陆续报道猫、大鼠、兔、猪、猴等切除80％～90％胰腺并受到高糖饮食刺激后，出现β细胞退变衰竭而引起永久性糖尿病。

（二)化学物质损伤

用化学物质损伤来复制糖尿病动物模型，可用的方法有：

1．注射致高血糖因子；

2．注射链脲佐菌素（streptozocin，STZ)；

3．注射环丙庚哌；

4．注射四氧嘧啶（alloxan)破坏胰岛β细胞，造成胰性糖尿病；

5．注射根皮苷。一般以后两种方法最常用。

(1)四氧嘧啶

①复制机理

用适量的四氧嘧啶注入动物体内，可选择性地损害胰岛的β细胞，使β细胞制造胰岛素的功能发生障碍而导致血糖过高和糖尿病。这是由于四氧嘧啶化学性质极不稳定，易与巯基（主要是半胱氨酸)发生反应，而胰岛的β细胞中巯基含量较其他组织为多，故四氧嘧啶只选择性地损害胰岛的β细胞。

四氧嘧啶复制的糖尿病动物模型是目前研究人类糖尿病较好的方法，主要优点有：（a)实验性糖尿病近似人类糖尿病；（b)体内代谢障碍时有可能产生此种衍生物；（c)胰岛外分泌部分不受损伤；（d)几乎所有常用实验动物都可用来进行实验研究；（e)胰岛的β细胞不是功能消失，而是功能不同程度的降低，有利于研究胰岛组织再生和功能恢复；（f)动物不必注射胰岛素可存活很久。

②复制方法

大白鼠  实验前四天，给大白鼠腹腔内注射新鲜配制的四氧嘧啶（2.5％或5％生理盐水溶液)，剂量为12mg/100g体重。注射后血糖呈几个时相的变化，在注射第四、五天后即可造成持续高血糖。实验中每天注意给动物充分供应饮水，以便获得较多尿量，用以测定尿中糖含量。如在冬季，大白鼠饮水少，则可由食管插管按5ml/100g体重喂水。

家兔   取体重1.5kg以上健康家兔，先测定正常血糖量，并检查尿内有无糖后，静脉注射四氧嘧啶溶液150～200mg/kg体重，然后有计划地观察血糖、尿糖、体重和食欲情况的变化。有的家兔在注射后10～15天排除中毒现象后，即可正式进行四氧嘧啶性糖尿病的实验观察。

家犬   实验前二周，静脉注入新鲜配制的四氧嘧啶溶液（1～3％)，剂量为50～60mg/kg体重。在注射后24～48小时，即可出现持久性的高血糖和糖尿。

注意事项：四氧嘧啶模型与人的糖尿病类似，但注射药物后，血糖值迅速下降，继而又很快上升且有几次起伏，几天后方形成持久性高血糖。另外，注射四氧嘧啶后，有时可在24小时以内死于低血糖昏迷，可用50％葡萄糖水溶液喂动物抢救。

(2)根皮苷

①复制机理

根皮苷是一种配糖体，系由苹果树的根皮抽提而得。其所以引起糖尿病，是因为根皮苷能使肾小管对糖的再吸收发生障碍（排糖阈降低)。根皮苷可能有破坏酯酶的作用，致使葡萄糖磷酸化过程和脱磷酸过程障碍，引起糖尿病。

②复制方法

使用的动物为健康家兔，首先测定正常血糖含量和尿糖定性，在确定血糖含量处于正常范围内和尿内无糖时，以0.5％根皮苷按15ml/kg体重的剂量作皮下注射，同时收集24小时尿液，然后测定血糖含量和尿糖定性。为了增加尿量，可多饲以白菜。

注意事项：根皮苷溶液要新鲜配制，配时取0.5g根皮苷溶于100ml的1％NaHCO₃溶液中。

(3) 链脲佐菌素

一次性腹腔注射或静脉注射30mg/kg～100mg/kg，几天后使狗、大鼠等动物产生永久性高血糖，但链脲佐菌素（streptozocin，STZ)造成糖尿病的同时，还可造成白内障、冠状动脉粥样硬化斑块。 

(4)环丙庚烷（cyproheptadine)

给大鼠连续给药4周后，可见高血糖症状，并出现胰岛素β细胞的分泌颗粒逐渐消失。胰岛素分泌在安静时呈正常值，当补充葡萄糖过量时，则不能引起胰岛素的补充分泌，这与人类糖尿病患者动态极为相似，停药一周后，病态可自动恢复，该模型比上述模型更接近于人体发病形式。

（三)微生物感染

脑炎心肌炎（EMC)病毒的M型变异株可在若干品系的成年小鼠中诱发糖尿病。在DBA/2品系小鼠中发病率大于70％，而在CD-1小鼠中约为40％，在C3H、C57BL、BALB/CJ与A/J小鼠中发病率少于10％。雌雄均能感染EMC病毒，雄性的发病率明显大于雌性。 皮下接种病毒4～7天后可出现明显的高血糖，伴有血中及胰腺组织中胰岛素含量降低。高血糖通常为短暂性，但许多小鼠在恢复期仍显示糖耐量异常。EMC病毒感染小鼠后出现的疾病在生化方面与人类青少年发病的IDDM糖尿病极为相似。

（四)营养源性

用含10％氧化的长颔竹刀鱼油的饲料喂养鲤鱼60天，即能诱发鲤鱼营养源性糖尿病。本病的临床特征包括高血糖、糖尿、糖耐量降低与偶有酮尿。组织学研究表明其胰岛、肾小球等部位的损害与人类糖尿病中所见者极相似。该疾病模型与人类青少年发病的IDDM糖尿病极为相似。

最近有报道，用含10％猪油、37％蔗糖的饲料喂养新西兰白兔也能诱发糖尿病，但该模型尚在研究中。

（五)转基因糖尿病动物模型

虽然转基因动物这一生命科学研究的新体系引入到糖尿病的研究领域时间并不长，但已取得了惊人的成果。转基因动物模型在糖尿病研究中的运用仍然方兴未艾。1998年，Allison等在《Nature》上报道，第一类组织相容性抗原复合物（MHC-1)基因（H-2Kb)，该基因是大鼠的胰岛素启动子，在小鼠的胰腺β细胞中高表达，复制成转基因小鼠。这种动物模型的胰岛素分泌降低，与人类的IDDM糖尿病相似。

利用转基因的方法建立人类疾病动物模型和用其他方法相比具有许多优点。诸如遗传背景清楚，遗传物质改变简单，建立的模型更自然和更接近病人症状；建立过程操作简单，周期短，而且建立的转基因动物模型不需要特殊的饲养条件即可保持疾病症状，按照孟德尔规律代代相传，维持费相对较低等等。但是由于转基因方法和技术上的原因，目前转基因糖尿病动物模型尚处于研究阶段，相信随着转基因技术的不断完善，人类疾病的转基因动物模型会不断涌现。

（袁中华)

 第四节  心、脑缺血-再灌注损伤动物模型

心、脑血管缺血性疾病是严重威胁人类健康的一大类疾病，椐统计，我国每年新发生的脑卒中有150万人，每年死于心血管疾病的在200万人以上，恢复缺血组织的血液灌注是治疗的目的，但在某些情况下，再灌注会加剧组织的损伤，其发病机制至今尚未阐明。因此，研究心、脑缺血-再灌注损伤的发病机制及其防治，具有重要的理论价值和实践意义。

一、在体心脏缺血-再灌注损伤模型

（一)实验目的

复制心脏缺血-再灌注损伤动物模型，观察再灌注过程中心功能的变化及再灌注性心律失常表现。为研究心脏缺血-再灌注损伤的机制及其防治打下基础。

（二)实验动物

雄性健康大白鼠，体重200~300克。

（三)药品、器材

多功能生物信息采集仪或二道生理记录仪，小动物人工呼吸机，小动物常规手术器械，左心室导管，直径3mm 、长2cm的充气硅胶管，小拉钩。小圆针，5/0号线。

（四)观察指标

1．心电图

2．心功能检测指标：左室内压（LVP)，左室内压变化最大速率（±dp/dtmax)，左室舒张末期压（LVEDP)

（五)实验步骤

1．动物称重后，腹腔内注射12%水合氯醛40mg/100g体重麻醉动物，并将其仰卧固定 

于手术台上。

2．作颈部正中切口，分离气管并插入气管插管，分离右颈总动脉，结扎远心端，近心端用动脉夹夹闭，在靠近结扎线处剪口，插入左心室导管，用线轻扎固定后松开动脉夹，然后将导管缓慢插入左心室，双重结扎固定，并连接多功能生物信息采集仪或生理记录仪用于测定心功能，连接标准肢体Ⅱ导联记录心电图。

3．胸骨左侧旁约0.5cm处、第3~5肋间作切口开胸，立即行呼气末正压呼吸（吸室内空气，通气量为2ml/100g体重，呼吸频率50~60次/min)，剪开心包膜暴露心脏，以左冠状动脉为标志，在左心耳根部下方2mm处用穿好5/0号线的无创小圆针穿过左冠状动脉下方的心肌表层，在肺动脉圆椎旁出针，将心脏放回原处。

4．待心电图稳定10分钟后记录心电图、LVEDP及±dp/dtmax 。

5．静脉注入肝素100~200U, 在左冠状动脉穿线上方放置硅胶管并结扎动脉，使之压迫血管造成血管闭塞和左室壁缺血5~10分钟，每隔2分钟记录心电图及心功能指标，然后剪开结扎线，移去硅胶管，恢复血液灌流，继续观察30~60分钟。

6．记录解除结扎即刻及随后动态的心电图和心功能指标变化。

二、离体心脏缺血-再灌注损伤模型

（一)实验目的

学习Lagendorff离体心脏灌流技术，复制离体心脏缺血-再灌注损伤模型，观察再灌

过程中心脏功能、代谢及心电图的变化。为研究心脏缺血-再灌注损伤的机制及其防治打下基础。

（二)实验动物

健康雄性大鼠，体重200~300克。

（三)药品、器材

Lagendorff离体心脏灌流装置，超级恒温水浴，恒温水浴器，氧气袋，O₂ 、CO₂、N₂钢瓶，721分光光度计，多功能生物信息采集仪，天平，小动物手术器一套，Krebs-Henseleit缓冲液（K-H液)，水合氯醛，肝素，玻璃插管等。

  （四)观察指标

1．冠脉流出量（ml/min/g组织湿重)；

2．乳酸脱氢酶（LDH)含量；

3．心电图；

4．心功能：±dp/dtmax, LVP，LVEDP 。

  （五)方法、步骤

1．Lagendorff离体心脏灌流模型的制备

（1)物称重后用12%水合氯醛40mg/100g体重（或氯氨酮8~10mg/100g体重)腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上，经尾静脉或股静脉注入肝素钠100~150U/100g体重，注射完毕后2分钟开始手术。

（2)肋骨下缘横向剪开腹前壁，再纵向剪开两胸侧壁和横膈前缘，将胸壁向头端翻起分离出心脏后以左手姆指和食指轻轻提起，暴露出各大血管，在距主动脉起始部4~5mm处，用眼科剪将肺与心脏一同剪下，置于预冷的0^оC~4^оC的K-H液中。

（3)立即行主动脉插管、固定，并迅速经插管（可用注射器与之相连)注入K-H液，冲洗出冠脉血管内的残留血液，然后将主动脉插管与Lagendorff灌流装置相连，让心脏悬挂于灌流装置上,灌流约30秒。

（4)肺动脉圆锥处剪一小口，用线结扎肺门根部血管，剪去肺及纵隔组织。

（5)左心房插管与前负荷瓶相连，荷包缝合固定；调整左室前负荷为15cmH₂O(147Pa),待心跳规则后，即改为从左心房导管灌入K-H液，液体经左室收缩泵入主动脉，部分液体进入冠脉，流至右房，经右心室从肺动脉圆锥流出，收集在烧杯中，用来测定冠脉流出量及乳酸脱氢酶含量，左室后负荷为60~75mmHg (8~10kPa)。持续向K-H液中通以（95%O₂+5%CO₂)混合气体。灌注压为7.9 kPa,灌注速度为10ml/min 。心脏维持湿润及37^ΟC恒温。

（6)经心尖部向左心室插入心导管，与压力传感器及多功能生物信息采集仪相连，测定心功能；连接心电图描记装置记录心电图；稳定10分钟后，记录各指标。乳酸脱氢酶（LDH)含量测定方法见药盒说明。

2．心脏缺血-再灌注损伤模型的制备

（1)用穿好5/0号线的无创小圆针穿过左冠状动脉下方的心肌表层，在肺动脉圆椎旁出针，在血管上方放置一小段硅胶管并结扎造成左心缺血10~20min ，记录结扎前及结扎后即刻、5min、10min、15min、20min心电图及心功能变化，并测定冠脉流出量及LDH。

（2)松开结扎恢复灌流，继续观察10~20min ，并在松开结扎后即刻、30s、60s、1min、2min 、5min、10min、15min、20min记录上述指标的变化。

3． 氧反常及钙反常的复制

（1)氧反常的复制方法：仍采用上述Lagendorff离体心脏灌流模型,先用通入（95%O₂+5%CO₂)混合气体的K-H液灌流20min , 然后改用无糖的、通入（95%N₂+5%O₂)混合气体的K-H液灌流90~120min , 再恢复先前的富氧含糖K-H液灌流5~10min,并动态记录前述指标变化.

（2)钙反常的复制方法: 采用Lagendorff离体心脏灌流模型,先用富氧含钙的K-H液灌流20min ,然后改用富氧无钙的K-H液灌流5~10min,再恢复富氧含钙K-H液灌流, 继续观察5~10min , 并动态记录前述指标变化.

附：K-H液的组成（mmol/L)：NaCl:118, KCl: 4.7,MgSO₄,:1.1,KH₂PO₄:1.18, NaHCO₃: 24.5, CaCl₂:2.55。Glucose:11.1（临用前加)，pH 7.4 。

三、脑的缺血-再灌注损伤模型

（一)四血管阻断模型

1、实验目的

复制脑缺血-再灌注损伤的动物模型，观察动物脑再灌注损伤的表现，为研究脑缺血-再灌注-损伤的机制及其防治打下基础。

2、实验动物

雄性健康大白鼠，体重200~300克。

3、药品、器材

多功能生物信息采集仪，小动物人工呼吸机，三棱针，不锈钢电极，小动物手术器械，12%水合氯醛等。

4、观察指标

脑电图，瞳孔及结膜颜色，心电图。

5、实验步骤

（1)物称重后，用12%水合氯醛40mg/100g体重行腹腔麻醉。

（2)卧位固定，沿头顶部正中线切开皮肤，在右冠状缝后，中线旁开各约1mm处用三棱针钻透颅骨达骨膜外，将开口稍加扩大，安装不锈钢电极，作记录脑电图用。

（3)将动物改为仰卧位，作颈部正中切口，分离气管并插管固定；分离两侧颈总动脉，置套扣备用。

（4)将颈部切口稍往下延伸沿右侧颈总动脉向近心端分离，找到锁骨下动脉的起始段，分离锁骨下动脉并穿线备用；沿左颈总动脉向下分离，找到左锁骨下动脉的起始段，分离该动脉并穿线备用。

（5)使用小动物呼吸机进行人工呼吸（通气量为2ml/100g体重，呼吸频率48~50次/min)；将安装在头顶部的不锈钢电极与多功能生物信息采集仪的脑电图负极相连，再将参比电极插在同侧耳根皮下，然后连接标准肢体Ⅱ导联，同步记录脑电图和心电图。

（6)用小动脉夹夹闭双侧颈总动脉和锁骨下动脉，分别于夹闭后即刻、5min、10min和15min重复记录脑电图和心电图，并观察瞳孔和结膜颜色的变化。

（7)松开动脉夹，于松开后即刻、10min、20min、40min和60min记录脑电图和心电图，并密切观察瞳孔和结膜颜色的变化。

此模型可住院医师造成动物全脑缺血-再灌注损伤，成功率较高，稳定可靠，但对呼吸循环影响较大，必须使用人工呼吸机。

（二)线栓大脑中动脉模型

本方法的特点是在不开颅的情况下，用尼龙线栓塞大脑中动脉造成局灶性脑缺血，抽出尼龙线形成再灌注。在实验操作上是分离出颈内、外动脉后，将颈外动脉的分支及其终末支以及颈内动脉的的颅外分支全部结扎，使颈内动脉成为颈总动脉在颅外的唯一分支，然后导入尼龙线。

1、实验动物

大鼠，体重350~ 500g 。

2、药品、器材

12%水合氯醛、0.3mm的硅化的尼龙线、小动脉手术器械等

3、实验步骤

（1)用12%水合氯醛（40mg/100g体重)行腹腔麻醉，仰卧固定于手术台上。

（2)颈部正中切口，在一侧肩胛舌骨肌和胸锁乳突肌形成的暴露颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，然后分离颈外动脉的分支枕动脉、甲状腺上动脉、舌咽动脉及其终末分支，并结扎之。分离颈内动脉及其颅外分支，并将其颅外分支结扎。

（3)动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉，用一线绕住颈外动脉的残余部并在结扎线的下方（近颈内、外动脉的分支处)剪一小口，由此插入预先硅化好的3cm长、0.3mm粗的尼龙线，松开颈内动脉夹，小心地将尼龙线导入颈内动脉，并仔细观察辨认位置是否正确，然后继续向前推进至颈内动脉的颅内段（从插入前端到颈总动脉分支处长度约为2cm)，当有明显的阻力感时，即可阻断大脑中动脉。

本模型的优点是无须开颅，重复性好，与临床较为接近，适用于脑缺血-再灌注损伤的病理生理研究。缺点是手术方法较为烦琐。

4、大鼠局灶性脑缺血评分方法：大鼠清醒后，根据其行为评分：

（1)提鼠尾离地面约1尺，有左肩内旋、左前肢内收者，记4分，否则为0分，正常鼠则两前肢对称地伸向地面。

（2)将动物置平滑地板上，分别推左（或右)肩使其向对侧移动，检查抵抗推动的阻力，若发现推其右肩向左侧移动时阻力明显低于对侧者，根据其降低程度的不同，记1~3分，正常大鼠两侧阻力明显对称。

（3)将动物两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力，若左前肢肌张力低于对侧者，视其降低的程度，记1~3分，正常大鼠两前肢肌张力明显对称。以上评分满分为10分，记分越高，说明缺血-再灌注损伤越严重。还可将脑组织染色测定梗塞面积，根据梗塞面积大小判定损伤的程度。

  (冯大明)

第五节 胃癌实验动物模型

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，尤其在我国的发生率和死亡率仍居首位。建立类似人胃癌的动物模型是研究胃癌的病因、发生、发展及实验性防治的重要手段和方法。胃癌实验动物模型分为诱发性与移植性两大类。

一．诱发性胃癌模型

理想的实验性胃癌模型必须具备下列要求：①致癌物质必须容易合成或取得；②能在各种动物中致癌；③致癌方法简单易行；④致癌周期短，癌变率高；⑤对胃有特异选择性；⑥所诱发的胃癌的病理类型、生物学行为、电镜表现及组织化学改变等与人类胃癌有相似性。

（一)致癌剂（carcinogen)

目前，诱发性实验性胃癌采用的致癌剂多为亚硝胺类，如甲基硝基亚硝基胍（MNNG)、甲基硝基亚硝基脲（ENNG)、甲基苄基亚硝胺（MBNA)等或芳香多环烃类（如3－甲基胆蒽、3，4－苯并芘、7，12－二甲基胆蒽、20－甲基胆蒽等)。

（二)实验动物（experimentalanimal)

实验性胃癌模型的成功与否和实验动物的选择密切相关。一般所用的实验动物有大鼠、小鼠、地鼠、犬等，而最常用的是大鼠，其饲养方便，胃癌诱发率高。大鼠的胃分为前胃和腺胃两部分，前胃占整个胃的1/3~1/2左右，由鳞状上皮细胞构成，腺胃由腺上皮细胞构成，前胃和腺胃之间有高出粘膜的界嵴相隔。因此。前胃诱发的是鳞状细胞癌，腺胃诱发的是腺癌。实验证明，不同种系大鼠的胃对致癌物的易感性不同，有人发现Wistar大鼠对MNNG较敏感，雄性大鼠的胃癌诱发率高于雌性大鼠。不同周龄的大鼠对MNNG较敏感性亦不同，一般幼龄大鼠较成年鼠更敏感，因此，选用2~4月龄、体重100~200g的大鼠较为妥当。

（三)实验方法（experimentalmethod)

1．线结穿挂法：取小鼠或大鼠，行无菌手术，在腺胃粘膜面穿挂含甲基胆蒽（MC)的线结。含MC线结是用普通细线，在一端打结后，将线结置于盛有MC的玻璃试管内，在乙醇灯上微微加热，使MC液化渗入线结。一般MC的量为0.05~0.1g,可制10~20根线，每根线结约含5mg。手术埋线后大约半个月~1个月即可形成早期浸润癌，3~4个月诱癌率最高，且诱发的胃腺癌与人胃癌相似。本校肿瘤研究所（1977)在20-甲基胆蒽诱发大鼠胃腺癌病理形态学动态观察中，提出胃癌发生过程为：MCA→腺胃粘液颈细胞增殖、分化异常→肠上皮化生→腺瘤性增生或不典型增生→早期癌→浸润癌。

2．MNNG诱发法：给药方法有三种：

（1)连续给药法。即从实验开始至结束每日给大鼠饮用MNNG溶液，诱癌周期一般需一年或一年半。此法给药时间持续，药物积累多，剂量大，诱发胃癌的发生率高，但胃外肿瘤发生率也较高。Sugimura（1967)用6周龄的雄性Wistar大鼠进行研究，用33µg/mlMNNG溶液饮用的12只大鼠366~542天后，有8只在胃腺部发生腺瘤，4只为胃腺癌。另4只大鼠用83µg/mlMNNG溶液饮用6个月后改用167µg/mlMNNG饲养至371~382天，1只发生胃腺癌和腺瘤，2只发生腺瘤，1只为腺瘤伴平滑肌瘤。胃肿瘤主要发生在幽门区和胃窦部，肿瘤大小由粟粒斑块样到指尖大小的结节，并侵及浆膜。但在十二指肠、空肠和近端肠系膜有肉瘤发生。本校肿瘤研究所应用自制合成的MNNG先后成功复制大鼠胃腺癌（1979)。随后，用500µg/mlMNNG溶液，采取连续定量法诱发Wistar大白鼠胃腺癌病理形态学动态观察中（1988)，在第84、168、217天分别诱发出粘膜内癌、早期浸润癌及浸润癌与多灶性癌（47例胃癌共97个癌灶)，获得较高诱癌率（47/80)，癌灶大部分位于胃窦，粘膜混浊、灰白或灰黄是胃癌的最早期改变，认为胃癌变过程为：MNNG → 粘膜糜烂、缺损 →腺体再生性增生→腺瘤性增生（息肉和腺瘤)或不典型增生→早期癌（粘膜内癌和早期浸润癌)→浸润癌。同时，诱发出前胃鳞癌，诱癌率分别高达58.3%(-12月)、86.7%（-14月)、86.7（-20月)。此外，诱发胃平滑肌肉瘤13例。

（2)间隔给药法。有人选用SD系大鼠，用80mg/kgMNNG溶液喂养，每周一次，一共12周。给药后直至大自然死亡（平均226天)，病理解剖时发现，肿瘤多发于前胃（88/89)，胃腺癌发生率仅3/98。同时发现30%的大鼠有肝脏退行性改变、局灶性坏死和胆管增生性损害，可能单剂量过大引起。

（3)限期给药法。即以实验性开始连续给药6~7个月后停药连续饲养，直至自然死亡后进行尸检，发现胃腺癌发生率达40%，而连续饲养同剂量MNNG的大鼠只有16%，说明限期给药法诱癌率高，专一性强。

大动物中多选用犬制作实验性胃癌。犬的胃组织结构与人胃相似，可进行X线检查、内镜检查和活检，有利于对癌肿的发展过程、早期诊断、化疗效果评价等进行研究，但诱癌时间较长，一般要2年或更长的时间，费用较高，饲养管理较困难。MNNG化学性质不稳定，不能与食物混合喂养，而且容易诱发犬肠道平滑肌肉瘤而导致犬死亡。有人介绍用MNNG的乙基衍生物N-乙基-N`-硝基-N-亚硝基胍（ENNG)能成功地诱发胃印戒细胞癌，诱癌特异性强，其大体形态、组织学分型及肿瘤转移的途径均与人胃癌相似，并且小肠肿瘤发生率低。ENNG给药方法有两种：①将ENNG制备成1~1.5g/L溶液储存，给药时再用自来水稀释至100~150µg/ml，由犬饮用，容器需避光。给药150µg/ml6个月或100µg/ml 9个月后停药，大都在18个月后出现胃癌。②将ENNG溶解在含2%吐温溶液中，混入犬的固体颗粒饮料中喂食，每日2次，持续8个月。由于固体食物在胃内停留时间较长，能延长药物与胃粘膜的作用时间，缩短诱癌时间，增加诱癌效果。本校肿瘤研究所分别用MNNG、ENNG诱发了狗微小胃癌和癌前病变（1985)，发现胃癌的组织发生为多中心起源。

二．移植性胃癌模型

移植性肿瘤是指人或动物的肿瘤组织移植到异种或同种动物，传代后其组织类型、生长特性稳定，并能在受体动物身上继续传代成为可移植性瘤株。Rydard(1969) 首次将人结肠癌皮下移植于免疫缺陷动物裸小鼠获得成功，开创人鼠异种移植模型的新时代。80年代中期，国内外开始用体外培养的人胃癌细胞移植于裸鼠皮下，但因长期体外培养过程诸多因素的影响，其生物学特征与原发瘤有较大差异。

我校肿瘤研究所（1991)分别将人胃粘液癌和乳头状腺癌组织移植于裸鼠皮下，经鼠间传代20代以上，建立了GC－916与GC－915两株人胃癌裸鼠移植瘤株，经病理学、组织化学、免疫病理学和超微结构观察，证实裸鼠移植瘤保持了原发人胃癌的结构和功能，并具有表达突变型p53、rasp21蛋白及产生CEA的特性。

皮下移植模型虽能保持原发瘤的组织类型和生化特征，但缺乏人胃癌最典型的转移特性。为了克服这一缺陷，Hoffman（1991)创立了外科原位移植方法，即将新鲜的人肿瘤组织通过手术原位移植于裸鼠体内建立转移鼠模型。此新型模型不但保持原发瘤组织结构，而且较完整表达其包括转移在内的生物学行为。因此，它可广泛用于肿瘤转移机制、抗肿瘤治疗及寻找新的肿瘤基因。转移鼠模型无疑是这个领域近年来的重大进展，这将预示每个肿瘤患者都可由其自身肿瘤建立的转移鼠模型作为临床实践标准的新纪元的到来。

此外，裸鼠体内人类器官移植为诱癌实验奠定了基础，如人胚胎气管、支气管、鼻咽移植，分别诱发气管癌、支气管癌、鼻咽癌。我校肿瘤研究所（19医学招聘网95)用人胚胎胃粘膜成功移植于裸鼠，并用MNNG诱发了胃粘膜不典型增生与裸鼠平滑肌肉瘤。

  （苏琦)

第六节  肝纤维化动物模型

各种损伤因子所致的肝脏损伤，各种疾病引起的慢性肝病，都可使肝脏发生炎症、肝细胞坏死、纤维组织增生进而继发肝纤维化的病理改变。肝纤维化是指肝细胞受炎症刺激及坏死时，肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程，轻者称为纤维化；重者进而使肝小叶结构改建、肝细胞结节状增生及假小叶形成，称为肝硬化。生物化学测定，每克正常肝组织湿重平均有5.5~6.5毫克的胶原，而硬化的肝脏可高达20毫克以上。

肝纤维化（硬化)动物模型的建立，是开展肝纤维化（硬化)基础研究及实验治疗研究的重要手段。许多因子可以在实验动物引起肝纤维化（硬化)。在实验动物身上施以不同性质、不同剂量及不同作用方式的肝毒剂，可造成不同类型的肝纤维化（硬化)模型。按损伤因素和病因分类，主要有下述六种类型，对各种类型的肝纤维化（硬化)动物模型原理及造模方法作一全面的了解，有利于科研中选择和应用较为理想的肝纤维化（硬化)动物模型。

本节将各种肝纤维化（硬化)动物模型复制方法分述于下。

一、化学性损伤模型

（一)CCl₄中毒性肝纤维化（硬化)模型

四氯化碳（CCl₄)为一种选择性肝细胞原浆毒性药物，其作用机制为四氯化碳进入肝脏后引起肝小叶内中央静脉周围肝细胞坏死，继而引起以肝小叶内窦间隙为主的纤维组织增生，通过四氯化碳制备肝纤维化（硬化)模型的途径有口服、腹腔注射及皮下多点注射等。实验动物一般采用雄性Wistar大鼠，雌性大鼠肝纤维化形成率低。方法有以下几类：

1．单纯CCl₄法：一般采用如花生油、橄榄油等作溶剂制成50%CCl₄油剂。0.1~0.3ml/100g体重皮下或腹腔内注射，每周2次。肝纤维化形成时间较长，一般在12~15周，动物死亡率也较高。

2．CCl₄加苯巴比妥诱导法：于饮水中加入苯巴比妥（300~400mg/L)，同时CCl₄蒸气吸入或灌胃。灌胃方法为：在饮用苯巴比妥2周后，CCl₄灌胃，开始剂量为0.04ml，以后按体重增减调整CCl₄用量，每周给药1次。此法缩短了肝纤维化（硬化)形成时间，早期肝纤维化4~6周形成，8~10周形成肝硬化。动物死亡率仍在40%左右。

3．复合因子干预造模：采用高脂低蛋白食物，30%左右的酒精为唯一饮料，皮下注射CCl₄（第1次0.5ml/100g体重，以后每隔3天注射40%CCl₄油剂0.3ml/100g体重)。实验第6周末可形成肝硬化。该模型方法简单，肝硬化形成率高，动物死亡率低。

（二)致癌剂N-乙基亚硝胺（DEN)、二甲基亚硝胺（DMNA)、硫代乙酰胺（TAA)诱发肝纤维化（硬化)模型

DEN、DMNA是一种具有肝毒性、细胞毒性和免疫毒性的化合物。

DMNA造模方法为腹腔注射，腹腔每周注射DMNA3次，处理3周，结果17天即可见肝小叶中央区肝细胞坏死及嗜中性细胞浸润，21天可见胶原纤维沉积、局部脂肪变、胆管增生，中央静脉周围纤维沉积，此模型与人类肝硬化早期改变的胶原纤维沉积相似，可作为筛选抗纤维化药物的方便模型。
TAA制备模型的原理是TAA入肝后延长肝细胞有丝分裂过程，并阻碍RNA从胞核到胞质的转移，进而影响依赖酶的代谢过程，最终形成肝细胞坏死。肝实质的破坏引起间质内织缔组织的生成增多，从而引起纤维组织在局部的沉积，其形成的动物模型在血流动力学、形态学及功能上的改变均与人肝硬化相似。具体方法为用雄性wistar大白鼠，体重130克左右。第一次20mg/100g体重，从第二次起12mg/100g体重，用液体石蜡、橄榄油将CCl₄配成40%的溶液每周2次腹腔内注射；或饮水中加入0.03%TAA，3个月后100%形成肝硬化，动物死亡率约20%。

二、酒精中毒性和营养性肝纤维化（硬化)模型

酒精引起肝纤维化的主要机制是：酒精中间代谢产物乙醛对肝脏产生直接损害，其在肝脏使辅酶Ⅰ（NAD)转变为还原性辅酶Ⅰ（NADH)，从而其比值下降，而NAD／NADH比值下降使三羧酸循环受抑制，进而脂肪氧化减弱，肝内脂肪酸合成增多，当其增多超过肝脏的处理能力就形成脂肪肝，最终形成肝纤维化。

河福金等在大鼠常规喂养同时灌入酒精（56℃)、橄榄油等的混合液，4周后可见肝小叶中央区明显坏死或呈局灶性坏死、点状坏死，间质可见炎性浸润，电镜下可见肝细胞周围胶原纤维增生，此类模型可广泛用于酒精性肝病的研究，依其处于不同的时期可作酒精性脂肪肝及肝纤维化的研究.主要缺点是缺乏稳定。

丁霞等采用雄性Wistar大鼠，180~200g体重，每天清早用白酒-玉米油-吡唑混合液灌胃，另外间断给予高脂饲料（其中酒精摄入量为8~12g/Kg·d，玉米油为2g/Kg·d，吡唑为24mg/Kg·d)，造模时间为12周。可见不同类型的变性、坏死及胶原纤维增生，均有肝纤维化形成，但程度不一。

三、免疫性肝纤维化（硬化)模型

1．用异种血清制品建立肝纤维化模型，其主要原理是异种血清进入体内引发机体免疫应答反应，在肝脏主要是在门脉汇管区及中央静脉周围形成免疫复合物沉积，由沉积的免疫复合物引起局部炎性反应，进一步刺激胶原的增生而形成肝纤维化，并见汇管区主要分布肌成纤维细胞。

方法为：雄性Wistar大鼠，体重120~150克。尾静脉攻击注射异种人血清白蛋白，2次/周，第一周2~3mg/只，以后每次攻击增加0.5mg，直至4.5mg。维持此量，至少2月。攻击后60天纤维化达到最大限度且纤维化持续时间达260天以上。肝纤维化形成率约为85%。建立免疫性肝纤维化（硬化)动物模型，对于研究肝纤维化（硬化)的产生机制、早期诊断及评价药物疗效，是一种极有用的肝纤维化模型。

2．用细菌菌体成份建立肝纤维化模型，大鼠腹腔内注射链球菌胞壁提取物，可引起门脉区周围肉芽肿，为T细胞依赖性免疫应答损伤所致的肝纤维化，可用于研究肝纤维化过程中巨噬细胞、T细胞及其它细胞及这些细胞产生的细胞因子的作用。

四、总胆管结扎致肝纤维化（硬化)模型

其作用原理是形成人为的肝外胆道梗阻，从而引起梗阻部位以上胆管扩张、胆汁淤积、胆道内压力增高，并可引发肝内胆小管扩张破裂，由于肝内血管受到扩张胆管的压迫及胆汁外渗，肝细胞会发生缺血和坏死，纤维组织向胆管间伸展，包围肝小叶并散布于肝细胞周围，最终形成肝硬化。

动物选用健康的成年杂种狗，雌雄均有，体重12~21Kg。术前禁食12小时，戊巴比妥30mg/Kg静脉麻醉，上腹正中切口，分离总胆管2~3cm，近十二指肠处和近胆囊处各扎两道，从中切断胆总管。6~10周即可建立肝纤维化（硬化)模型。

由于造成的是完全性梗阻，所以建立模型的时间相对较短。该模型的肝功能试验异常及病理组织学所见，与人类小结性肝硬化的生化及组织学变化相似。

五、生物学模型

（一)虫卵致肝纤维化（硬化)模型

小鼠、家兔等动物感染血吸虫所致的肝纤维化（硬化)模型，病变特殊，可用于研究血吸虫病性肝纤维化（硬化)，但不适于其他类型的肝纤维化（硬化)。

小鼠皮下注射曼氏血吸虫尾蚴后，门脉区寄生虫卵沉积引发免疫反应产生炎症，6~8周肝纤维化形成，10~20周后形成肝硬化。肝脏胶原量可增加至正常的20倍，白蛋白合成也受抑制。

（二)病毒致肝纤维化（硬化)模型。

我国的肝纤维化大都继发于病毒性肝炎。因此，用鸭乙肝病毒（DHBV)感染鸭来制作病毒性肝炎肝纤维化（硬化)模型，有益于对病毒性肝炎肝纤维化（硬化)的肝纤维化机制和药物治疗的研究。

造模成功与否的主要因素有：（1)鸭种：北京鸭较为敏感。（2)DHBV接种剂量：7.5×10⁷~5×10⁹之间。（3)接种途径：包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、胚内注射，其中静脉注射感染率可达100%。（4)接种时机：孵出后24小时内接种最佳，此时，鸭免疫系统发育不完善。

方法举例：60~90g体重的1日龄樱桃谷鸭（英国鸭与北京鸭杂种)，经胫静脉注射鸭乙肝病毒0.1ml/只（含DHBV颗粒2.5×10⁹)。80天可见纤维组织轻度增生，100天纤维组织中度增生，112天约10%发生肝纤维化，约5%发生肝硬化。

（三)复合因素所致肝纤维化（硬化)模型

由于单因素造模时间长，成模率低，单一因素加大剂量不能提高肝纤维化水平，反而动物死亡率增高；复合因素造模，时间短，成模率高。

有CCl₄与乙醇联合使用，CCl₄与苯巴比妥、亚硝基胺合用，CCl₄与DMNA合用，乙醇与饱和脂肪酸或植物油、葡萄糖合用等等。如CCl₄与DMNA合用，肝纤维化时间可缩短至42天，且该模型可用于研究肝硬化向肝癌转化的机理。

肝纤维化（硬化)模型种类繁多，理想的肝纤维化模型需要符合以下特征：复制人肝纤维化（硬化)的病变模型；病理改变呈阶段性进展；模型制作的可重复性高且死亡率低；肝纤维化应具有可逆性和不可逆性病变过程；病理生理上一系列的病变过程与人类的相似。

总体上动物肝纤维化（硬化)模型能与人的肝纤维化（硬化)有形态学、血液动力学及生化方面相似的特点，但到目前为止没有与人肝纤维化（硬化)完全相似的模型，可能与人和动物之间的种属差异有关，但仍可依据不同的实验目的来选取相应的实验动物模型。

（朱建思)

第七节  呼吸衰竭动物模型

呼吸衰竭是由导致外呼吸功能发生严重障碍的疾病所引起，也是这些疾病发生发展过程中导致病人死亡的重要原因。根据PaO2降低或PaCO2是否升高，可将呼吸衰竭分为低氧血症型(Ⅰ型) 和高碳酸血症型(Ⅱ型) ，按发病机制不同，可分为通气性和换气性呼吸衰竭，因原发病变部位不同，可分为中枢性和外周性呼吸衰竭，根据病情的急缓分为急性和慢性呼吸衰竭。呼吸窘迫综合征（Respiratory distress syndrome,RDS)是临床上较常见的一型急性呼吸衰竭，于1967年由Ashbaugh首先提出，其临床特征为：进行性的呼吸困难和低氧血症，常继发于休克、创伤、烧伤、脓毒血症、氧中毒等多种病理过程。目前，利用实验动物复制RDS模型的方法有多种，如给予动物静脉注射油酸、甘油三脂、内毒素或吸高浓度氧、失血性休克等，本节主要介绍一种用动物异体骨髓提取液静脉注射的方法复制RDS模型。

一、动物

大鼠、家兔、家犬、猪等动物均可用于复制RDS模型，且不拘雌雄和品系，因大鼠和家兔体格小，提取骨髓较麻烦，而从家犬和猪提取骨髓较容易。

二、方法

（一)犬骨髓提取液的制备：

取犬新鲜长骨，刮除骨膜外组织，75%乙醇消毒后劈开。将劈开的长骨放入乙醚中洗出骨髓腔的骨髓，然后，用普通滤纸过滤，清除碎骨和组织等有形成份。骨髓与乙醚混合物放于烧杯中，加盖滤纸防尘，在常温下乙醚经48小时充分挥发后，得清亮微黄骨髓提取液，置冰箱备用。猪骨髓提取液制备方法与此相同。

（二)模型复制步骤

1．选取健康杂种犬或小型猪，体重4~8kg左右，雌雄不拘，以3%戊巴比妥钠1ml/kg静脉麻醉。颈部手术, 作气管插管, 分离颈总动脉和颈外静脉。

2．从右侧颈外静脉插入漂浮导管经右心房、右心室至肺动脉以备测肺动脉楔压(PAP)，从左侧颈总动脉插入普通导管至主动脉以备测主动脉压(Aortic presure，AP)。

3． 从左侧颈外静脉注入加温至38^．C的骨髓提取液，注射量按0.6ml/kg计算。缓慢注射历时1~2分种左右。

4． 注射骨髓提取液前后，全程监测主动脉压和肺动脉楔压。每小时测一次主动脉血pH 、Pa O_{2 、} 和PaCO₂  并计算肺泡－动脉氧分压差(A-aDO₂)。

（三)模型复制结果判定

1．呼吸变化

 动物在静脉注入骨髓提取液后，10分钟内均表现出呼吸加深加快，1小时后，呼吸频率可达正常频率的3~4倍，3小时后呼吸频率开始趋缓，可有明显的吸气性呼吸困难。

2．血气和A-aDO₂ 变化

静脉注入骨髓提取液后，PaO₂开始逐渐下降，1小时后 PaO₂可低于60mmHg，而pH与PaCO₂无明显变化，但可见pH稍偏高，PaCO₂稍偏低。A-aDO₂ 正常值在海平面呼吸空气的条件下为10~30mmHg，差值增大说明肺泡氧弥散功能发生障碍，这是判定RDS的主要依据。RDS时因肺水肿、充血、出血等病变使肺通气/血流比值改变，导致的严重低氧血症不能单纯用提高吸入氧分数(FiO₂) 纠正。

A-aDO₂计算公式：

  A-aDO₂=［（大气压－水蒸气压)×吸入气氧浓度－（PaCO₂÷呼吸商)］－PaO₂＝

［（760－47)×0.21－（40÷0.8)］－PaO₂＝98－PaO₂    

3．PAP与AP

静脉注入骨髓提取液后，PAP快速升高并持续稳定在较高水平，3小时后再次开始缓慢升高。AP无明显变化。

4．肺病理形态变化

肺体积和重量增加使肺系数增大［肺系数＝肺重量(g)÷体重(kg) ］。镜检可见肺水肿、肺出血、微血栓、肺间质炎性浸润和增厚、肺透明膜形成。部分肺泡萎陷，部分肺泡呈代偿性扩张。

骨髓提取液中含有软脂酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸、豆冠酸、花生酸、蛋白质、氨基酸等成分，此外，还有一些未测成分。用骨髓提取液复制RDS模型，在发病原因上较单纯用油酸、甘油三酯更接近于严重挤压伤或骨折时机体大量释放脂质所致RDS，其引起RDS发生发展的主要机制为骨髓栓塞肺毛细血管造成肺微循环障碍。

  (金海燕)

第八节  多器官功能障碍综合征动物模型

多器官功能障碍综合征（MODS)主要是指严重创伤、感染、休克期间或复苏后，同时或者相继出现两个或两个以上器官功能障碍。在MODS发病过程中还出现失控的全身炎症、高代谢状态、高动力循环等全身炎症反应综合征（SIRS)及免疫功能失调。MODS可以逆转，并且可以不遗留器官损伤的痕迹，也不复发。但迄今为止其发病机制仍不清楚，早期诊断较为困难，缺乏行之有效的防治手段，发病率和病死率居高不下。因此，阐明MODS的概念和发病机制，找出早期诊断的指标和防治方法，具有重要的理论价值和实践意义。

一、单向速发型MODS动物模型

（一)实验目的

模拟多器官功能障碍综合征（MODS)的致病因素、发病过程和临床特征，研究MODS的发病机理及其防治措施

（二)实验动物

Wistar大鼠，200~300克，性别不拘。

（三)药品、器材

酵母多糖粉剂（zymosan A,Sigma公司)、医用石蜡、3%戊巴比妥钠、无菌生理盐水、无菌林格氏液等。高频磁力搅拌器，注射器等。

含酵母多糖石蜡液的配制：将酵母多糖粉剂1克加入20毫升医用石蜡中，用高频磁力搅拌器混匀制成悬液，置100^oC水浴中消毒后备用。

（四)实验步骤

动物分为三组，实验组、石蜡对照组和正常对照组。实验组动物腹腔注射含酵母多糖石蜡液1.5~2ml /100g体重，石蜡对照组动物腹腔注射医用石蜡液1.5~2ml /100g体重，正常对照组动物腹腔注射无菌生理盐水1.5~2ml /100g体重。实验组与石蜡对照组动物于实验第一天腹腔补充无菌生理盐水10ml /100g体重，第二天补充5ml /100g体重，第三天及第四天分别补充2.5~1.25ml /100g体重。分别于第二天和第五天放血或断头处死动物，处死前左心室取血检测PaO₂ 、GPT、 Cr，处死后取主要脏器作大体检查和常规石蜡切片作光镜检查，必要时作常规透射电镜制样，用作超微结构观察。

（五)结果判定

注射酵母多糖动物第2天，平均动脉压明显降低，尿量显著减少，血肌酐及谷丙转氨酶显著升高，嗜睡、反应低下，门静脉和肝静脉血培养阳性率显著高于对照组；具有明显SIRS的表现，病理改变主要为各脏器组织水肿、出血和炎症细胞浸润，可见实质细胞变性、坏死、脱落，部分动物在2天内死亡。至第5天，上述病变有所减轻。

此模型较易复制，死亡率较低（33%左右)，有明显的SIRS和多器官损害。其中以肺脏发生最早、最严重。但致病因素与临床有一定差距。本模型适用于发病机制研究。

二、双相迟发型MODS动物模型

（一)鼠双相迟发型MODS模型

1．实验目的

模拟多器官功能障碍综合征（MODS)的致病因素、发病过程和临床特征，研究MODS的发病机理及其防治措施。

2．动物与分组

Wistar大鼠，体重200~300克，性别不拘。

3．药品、器材

大肠杆菌内毒素（E.Coli O₅₅B₅)，3%戊巴比妥钠，无菌林格氏液，动、静脉插管，输血、输液器材，注射器等。

4．实验步骤

动物术前12小时禁食，戊巴比妥钠3mg/100g体重腹腔麻醉。行一侧颈动、静脉分离与插管，动脉插管用于检测血压和放血。动物分为三组，首次打击组采用失血性休克和再灌流损伤。按Wigger’s法在3分钟内快速放血，使平均动脉压迅速降至4kPa (30mmHg ),然后缓慢放血，使平均动脉压维持在4~4.7kPa (30~35mmHg )，持续2小时。之后将全部放出的血液及其1倍容量的林格氏液经颈静脉快速回输（15分钟内完成)，造成缺血-再灌注损伤。首次加第二次打击组在复苏后6小时实施第二次打击。第二次打击组不作前述处理，仅从腹腔1次性注射大肠杆菌内毒素（E.Coli O₅₅B₅)2mg /100g体重，造成腹膜炎和脓毒症。注射后4小时，经腹腔补充林格式液5ml /100g体重。整个实验观察72小时。

5．结果

动物有SIRS表现，首次加第二次打击组心、肝、肠等脏器功能障碍发生率约为50%，死亡率大于30%，而首次打击组和第二次打击组基本不出现MODS。

本模型损伤因素和发病过程均与临床接近，适合于SIRS或双相迟发型MODS机理及防治方面的研究。

（二)标准化的MODS模型

1．实验动物

1年龄的雄性山羊，体重25公斤左右。

2．药品、试剂

大肠杆菌内毒素（O₂₆B₆), 3%戊巴比妥钠，林格式液，10%脂肪乳剂和葡萄糖液，复合氨基酸等。

3．动物ICU的建立

基本设备：1)心功能监护仪：能进行全套血流动力学监测  2)多功能呼吸机：能监测呼吸频率、潮气量、气道阻力、肺顺应性、吸入氧浓度，并具备PEEP功。 3)输液泵和注射器泵：用于循环治疗。4)氧气管道用于氧疗。5)负压吸引装置，用于吸痰和胃肠减压。6)动物代谢笼和动物固定装置。7)具有空调、净化和通风设备。

4．实验步骤

模型复制分为受次打击（手术创伤+失血性休克+复苏再灌流)、二次打击（门静脉内毒素血症)和器官支持三个阶段。动物分为首次打击组、二次打击组、首次+二次打击组。山羊用戊巴比妥钠30mg/kg体重腹腔麻醉，颈部手术行气管插管、颈总动脉、颈静脉和肺动脉插管。上腹正中切口，自肠系膜上静脉插管至门静脉，监测门静脉血流量（PVF)，作胃和回肠造瘘置入胃肠粘摸张力计监测胃和小肠粘摸pH (pHi )；首次打击组术后20分钟采用Wiggers法造成失血性休克，平均动脉压维持在6.0~7.3kPa 1小时。之后经静脉和门静脉快速输回放出的血液及其2倍容量的林格氏液。此时，MAP和心脏指数（CI)均能恢复至休克前的80%以上；第二次打击组于复苏后24小时经门静脉持续输入大肠杆菌O₂₆B₆内毒素30ng /kg·min ，持续5天。

器官功能监护和支持：进行持续呼吸和循环功能监护，当心血管或/和呼吸功能不全达到1分（见后)时，施行机械通气或/和输入多巴胺维持血压。整个实验过程进行代谢监测和标准代谢支持，热卡按2倍基础能量消耗（山羊实测为85.8±3.9k/kg.·d)，静脉输入复合氨基酸、10%脂肪乳剂和葡萄糖溶液补给。补充蛋白质1.45g/kg·d，热卡与氮的比例为 2180：1，常规补钾1。5/d ，水100~150ml/kg·d。

   5．检测指标

（1)炎症介质：测定TNF、IL-6、IL-8等；

（2)器官功能：测定血气和心、肝、肾以及血液酶学或生化指标；测定门静脉血二胺

氧化酶（DAO)、小肠pHi以及尿中乳果糖与甘露醇排除量的比值作为评价肠屏障功能的参考；

（3)血细菌培养、内毒素测定和脏器细菌定量；

（4)物质代谢：测定血葡萄糖、游离脂肪酸、尿三甲基组氨酸和全血乳酸含量；

（5)血流动力学：用心功能监护仪测定并计算体循环、肺循环和门静脉血流动力学和氧代谢指标；

（6)病理形态学检查。

本模型为标准化的MODS动物模型，最大限度地模拟临床MODS的病因、发病过程和功能、代谢变化，是研究MODS发病机制及其防治的好的动物模型。

表15-2 动物SIRS的诊断依据

表15-3动物MODS时器官功能障碍分期诊断及评分标准

 注：P（A-a)O2:肺泡动脉氧分压差；pHi：粘膜内pH值；L/M：尿中乳果糖与甘露醇排出量的比值；FENa；滤过钠排泄分数；GPT：谷丙转氨酶

  （冯大明)