第十二章 神经系统
第一节 神经干动作电位及其传导速度的测定
[实验目的]
掌握神经干标本制备、动作电位（actionn potential ,AP)及其传导速度的测定与计算方法，了解其测定原理与相关仪器使用方法；观察、识别蟾蜍坐骨神经干双相和单相动作电位，测定其传导速度；分析机械损伤或局麻药、低温对神经干AP及其传导速度的影响；
[实验对象]
蟾蜍或青蛙。
[药品、器材]
PCLAB生物信号采集处理系统一套、神经标本盒、蛙类手术器械、滤纸、棉球、缝合线、任氏液、烧杯、滴管等。
[观察指标]
蟾蜍或青蛙坐骨神经干双相、单相动作电位及其传导速度
[方法、步骤]
(1)制备坐骨神经干标本
破坏脑脊髓：取蟾蜍一只用自来水冲洗干净，左手握蟾蜍，小指和无名指夹住后肢，拇指按压背部，中指放在胸腹部，用食指下压头部前端使头前俯(图12-1)，右手持金属探针由枕骨沿正中线向脊柱端触划，当触到凹陷处即枕骨大孔处，可将探针由此垂直刺入皮肤入枕骨大孔后，将针折向前方插入颅腔并左右搅动捣毁脑组织，而后退针至刺入点皮下，针尖向后刺入脊椎管捣毁脊髓，当四肢松软、呼吸消失则表示脑脊髓完全毁坏，否则应按上法重复操作。
图12-1 破坏蟾蜍脑脊髓的方法
剪除躯干上部及内脏： 在骶髂关节水平以上lcm处用粗剪刀剪断脊柱，左手执镊子夹紧脊柱断端(骶骨端)并稍向上提起，使蟾蜍的头与内脏自然下垂，右手持大剪刀，沿两侧将蟾蜍的头、前肢和内脏全部剪除并弃置污物桶内(图12-2)，仅保留后肢，腰背部脊柱及由它发出的坐骨神经丛(呈灰白色)。
图12-2 剪除躯干上部及内脏
去皮：左手持粗镊夹住脊柱断端，不要夹住或触及神经，右手捏住其上的皮肤边缘向下撕去背部的皮肤后，剪去大小腿的全部皮肤。将手和用过的剪子、镊子、蛙板等全部手术器械用自来水冲洗净，再行以下操作。
分离两腿：沿正中线将脊柱剪分为两半（勿损伤坐骨神经)，并从耻骨联合中央剪开两侧大腿，使两腿完全分离，将两腿浸于盛有任氏液的烧杯中。
游离坐骨神经：取一后肢，腹面向上认清坐骨神经及其走向后，在靠近脊柱处穿线结扎，并在结扎线上剪断神经，线头保留约1cm。用镊子夹住线头，提起坐骨神经进行分离，沿坐骨神经沟(股二头肌与半膜肌之间的裂隙处)分离出大腿部的坐骨神经并用玻璃针轻轻勾起坐骨神经干，剪断所有分支，分离至月国窝处可见有两条分支，即胫神经和腓神经。剪去任一分支(腓神经较浅，易分离，常保留)，继续分离留下的另一分支(也可两支都分离)，直至脚趾端。用线结扎，在结扎线的远端，剪断腓神经，也保留一小段线头(约1cm)，全长须在8厘米以上。将此完全游离的坐骨神经干置于盛有任氏液的烧杯中备用。按同样的方法，分离另一根坐骨神经干备用。
（2)连接实验装置（图12-3)
将引导电极、刺激输出线分别插入计算机主机输入2、刺激输出并与神经标本盒相应电极相连。
（3)用任氏液棉球擦拭干净神经标本盒全部电极，镊子夹住神经干标本两头的线头，将标本安放在电极上（粗端放在刺激电极上，细端放在引导电极上)。
（4)观察坐骨神经干双相动作电位。开机，双击PCLAB图标进入生物信号采集处理系统。按前面介绍的使用方法调试好仪器后，点击“刺激”按钮，系统开始采样，适当调整各通道放大倍数及X、Y轴压缩比，即可产生双向动作电位。如改刺激参数为刺激个数为2，并适当增加时间间隔至1秒，即可观察到神经干的2个双向动作电位。
图12-3 实验装置示意图
（5)测定神经兴奋传导速度。抬起放大器面板上，S—R按钮，并调整第四通道放大倍数，可在第四通道上观察到比第二通道在时间上稍有延迟的第二个动作电位，同时测定神经兴奋传导速度（V= d/T，V：神经干AP传导速度；d：R1与R2之间的距离；T：两个AP起点的间隔时间)：①测量正常AP传导速度， ②将标本置于4℃任氏液中浸泡5分钟后，观察AP变化测定其传导速度。
（6)调换标本方向，观察AP有无变化。
（7)保持刺激电极与引导电极间距离不变，改变两引导电极（R1与 R2)间距离观察双相AP变化。
（8)对调两引导电极的位置，观察双相AP变化。
（9)在两引导电极之间滴一滴普鲁卡因，观察AP波形变化。
（10)用镊子将两引导电极之间的神经夹伤，观察AP波形的改变。
（11)实验结束后，选取“文件”下的打印，打印实验结果。
[注意事项]
（1)神经干应尽可能分离得长一些，全长须在8cm以上。
（2)神经干分离过程中慎勿损伤神经组织，以免影响实验效果。
（3)神经干两端要用细线扎住，然后浸于任氏液中备用。
（4)实验时应盖上神经标本盒的盒盖并接地，以防干扰与神经干燥。
（5)坐骨神经干标本可直接从剪断躯干开始制备。
（6)指导图12-3中S1 S2:刺激电极；R1R2：引导电极。
[思考题]
（1)神经干双相和单相AP产生、传导和引导原理如何?本实验采用方法是细胞外记录方法，此外还有何种方法记录AP？
（2)神经干AP与单一神经纤维的AP有何区别?何谓神经干复合AP？
（3)为什么一般情况下记录到的双相动作电位的波形是不对称的?
（4)低温、标本倒向、改变两引导电极间距离、对调两引导电极的位置、改变刺激电极和引导电极间的距离、用药物阻断或机械损伤等分别对神经干AP的波形、传导速度有何影响？为什么？
（5)何谓双向AP、单向AP，二者有何区别？本实验采用什么方法引导观察单向AP，另有什么方法引导出单向AP？
高治平 刘建芝
第二节 减压神经放电与动脉血压变化
[实验目的]
学习哺乳类动物在体神经干动作电位的引导和血压直接测量方法，观察机械刺激、电刺激、药物及神经体液因素对家兔血压的影响，分析减压神经放电的频率、幅度、声音与动脉血压的变化的相互关系。
[实验动物]
家兔。
[药品、器材]
生物信号采集处理系统一套、血压换能器1个、手术器械一套、动脉插管1个、兔手术台1个、双极银丝引导电极1根、铁支柱2个、试管夹、双凹夹2个、滴管1支、玻璃分针1个、25％氨基甲酸乙酯（或3%戊巴比妥钠)1瓶、生理盐水1瓶、肝素生理盐水1瓶、液体石蜡(加温38—40℃)1瓶、1：10000去甲肾上腺素1瓶、利血平注射液1支（或1：10000乙酰胆碱等药)、50ml注射器1个、1ml注射器2个、10ml注射器1个、纱布、纱带、缝合线等。
[观察指标]
（1)兔减压神经放电频率、幅度，监听放电声音（类似火车开动样的轰隆声)。
（2)兔动脉血压。
[方法、步骤]
（1)连接实验装置：将血压换能器、生物电引导电极与生物信息采集处理系统相连接。
（2)用50ml注射器抽取肝素生理盐水，从三通侧管注入血压换能器及其相连接的动脉插管内，排尽管内空气。
（3)麻醉与固定 ：秤量动物体重，用20％氨基甲酸乙酯（1g／kg)缓慢注入耳缘静脉，待动物麻醉后，将其仰卧（前肢背位交叉)固定于兔手术台上。
（4)分离减压神经、血管、气管
颈前部备皮后，颈部正中切开4-6cm，用止血钳分离皮下组织，分开胸舌骨肌，暴露气管，用左手拇指和食指捏住右侧切口的皮肤和肌肉，其余三指从皮肤外面略向上向外翻，暴露与气管平行的血管神经束，束内有颈总动脉、迷走神经(最粗)、交感神经(次之)和减压神经(最细)。仔细辨认三根神经，用玻璃分针将减压神经从血管神经束中分离出来1.5-2cm，分离须干净，动作要轻柔细致，并用温生理盐水浸湿过的细丝线在其下方穿过备用。用同样方法依次分离游船右侧交感神经、迷走神经、气管、两颈总动脉，分别穿线备用。
（5)做人工皮兜（也可不做)
用血管钳把神经周围的皮肤提起，做成人工皮兜，向皮兜内滴入38—40℃液体石蜡浸泡神经，保护神经以防干燥和温度降低，另外，液体石蜡还具有绝缘作用。
（6)行气管插管、左颈总动脉插管术，记录血压。
气管插管：在甲状软骨下2—3cm，两气管环间做倒“T”形切口，向下插入气管插管，用棉线结扎固定，便于呼吸通畅。
动脉插管：结扎左颈总动脉远心端后（保留结扎线)，在其近心端夹一动脉夹，动脉夹与结扎之间应相距3cm左右。在结的下方用眼科剪作一1/2斜切口，向心脏方向插入已灌满肝素生理盐水的动脉插管，扎紧插管尖端并固定于其侧管，以防插管滑出，松开动脉夹观察插管内液面是否有随心跳波动。
（7)用玻璃分针轻轻挑起减压神经放置于引导电极上，将电极固定于支架上，调节好引导电极于合适的位置，使电极与神经良好接触，电极不能与周围组织接触，但又不过度牵拉神经。然后，将接地线夹在附近切开的组织上。
（8)开机，双击生物信号采集处理系统图标。按使用方法调试准备好仪器后，点击“开始”按钮，系统开始采样，适当调整各通道放大倍数及X、Y轴压缩，在观察到理想的波形曲线时。（注意：应听到清晰的轰隆轰隆的神经放电比声音，如声音太小不清楚，可调节音箱音量旋钮，放大音量，或加大第一通道的放大倍数，一般在10000至20000倍即可)。
（9)观察正常血压曲线：辨认血压波的一级波和二级波，有时可见三级波。一级波（心搏波)由心室舒缩引起血压波动，心缩时上升，心舒时下降，频率与心率一致；二级波（呼吸波)，是呼吸运动引起的血压波动，吸气时，血压先降后升，呼吸时血压先升后降；三级波（不常出现)可能是血管运动中枢紧张性的周期性变化的结果。
（10)观察分析正常减压神经放电集群的特点，并监听其声音。
（11)向下牵拉右颈总动脉远心端结扎线5—10秒，观察减压神经放电频率、幅度、声音与血压变化相互关系。
（12)从耳缘静脉注射1：10000去甲肾上腺素0．2 -0．3m1，观察减压神经放电的频率、幅度、声音与血压变化相互关系。
（13)从兔耳缘静脉注射利血平2m1或1：10000乙先胆碱0.3 m1，观察减压神经放电频率、幅度声音与血压变化相互关系。
（14)用动脉夹夹闭右颈总动脉5—10秒，观察减压神经放电频率、幅度、声音与血压变化相互关系（注：从此步开始，如操作不便，可取下减压神经，仅观察下列因素对血压的影响)。
（15)电刺激减压神经（刺激幅度：1—2v，刺激时间：5-10s)，观察血压的变化。结扎剪断之，分别刺激中枢端与外周端，观察血压的变化，为什么？
（16)电刺激迷走神经（刺激幅度：1—2v，刺激时间：5-10s)，观察血压的变化。结扎剪断之，分别刺激中枢端与外周端，观察血压的变化，为什么？
（17)结扎剪断和刺激交感神经对兔耳血管网的影响。比较观察左右两耳血管网的数目和充血情况，然后结扎并于近心端剪断左交感神经，稍等片刻，比较观察左耳血管网与右耳有何不同？然后电刺激左交感神经头端（外周端)观察其血管网的变化，稍侯片刻，再观察左耳血管网又有何变化？为什么？
（18)从右颈总动脉缓慢放血20ml-50ml（或维持血压在40mmHg一定时间)，观察右耳血管网（及血压)的变化。然后快速补液（37℃生理盐水或5%的葡萄糖溶液)观察血压和右耳血管网及其颜色的变化。
[注意事项] 找准减压神经是实验成败的关键。
（1)麻醉不宜过浅，否则动物挣扎，拉断神经或产生肌电干扰。
（2)减压神经纤细，分离、勾起神经时，动作要轻柔细致，切勿盲目牵拉，以免损伤神经，影响放电。
（3)分离要干净，神经上不能附有结缔组织膜。引导电极与神经干须紧密接触并悬空，避免触碰周围组织，影响放电。
（4)实验过程中，可滴少量38—40℃的液体石蜡于减压神经起到绝缘和防止干燥的作用。
（5)引导电极两极间距为2mm左右，并要干燥，以防短路而影响电位记录。
（6)引导电极的导线要用屏蔽线，方可抗干扰。电极导线不宜过长，避免与电源线或其它干扰源的导线相交，以防产生干扰。
（7) 实验过程中，如发现电位幅度逐渐减小或50HZ干扰信号，应检查神经是否干燥，动物局部和全身温度是否过低等，适当给予相应处理。
（8)实验步骤10-13，均必须待减压神经放电及血压灰复正常后，方可进行下一步骤。
[思考题]
（1)夹闭、牵拉颈总动脉后，减压神经放电、血压各有何变化? 为什么?
（2)注入去甲和利血平后，减压神经放电、血压各有何变化? 为什么?
（3)观察心缩期与心舒期血压和减压神经放电的变化，分析减压神经放电与血压的相互关系。
（4)根据实验结果分析断减压神经是传入神经还是传出神经，并说明减压反射的调节方式、调节过程与生理意义。
（5)本实验或机能学动物实验中所采用的动脉血压测量法是属直接测量法，还是属间接测量法？
（6)请分析电刺激内脏大神经时，血压变化如何？为什么？
高治平 刘建芝
第三节 香烟的毒性作用
［实验目的］
观察烟对小鼠的毒性作用，以明确吸烟对人体的危害。
［实验动物］
小鼠。
［药品、器材］
水烟斗、火柴、1.0ml注射器、10．0m1量筒，香烟、生理盐水。
［观察指标］
小鼠的肌肉活动、呼吸、末梢循环情况，最后是否死亡。
［方法、步骤］
（1)量筒量取生理盐水4．0m1置于烟斗内，摇匀后，先用注射器抽取1．0ml液体(对照组用)，然后，将香烟插于水烟斗上并点燃，于烟斗嘴处用洗耳球抽吸促使继续燃烧(如图5-1)，使烟雾经烟斗内溶液过滤，此时，烟雾内部分水溶性毒物如尼古丁(烟硷)等，即溶于水中。
（2)取小鼠2只，观察正常情况后，甲鼠腹腔注射烟过滤液0.5m1，乙鼠则腹腔注射吸烟前烟斗内溶液0．5m1做对照，逐步观察并比较两小鼠的表现(肌肉活动、呼吸、末梢循环)。
实验结果填入下表：
表5-1 香烟滤液对小鼠的毒性作用
| 肌肉活动 | 呼吸 | 末梢循环 | 死亡 | |
| 甲鼠 乙鼠 |
［思考题］
含有尼古丁的烟过滤液为什么可使小鼠出现一系列中毒表现?
图5-1 a烟斗嘴 b生理盐水 c点燃的香烟
（黄红林 谢志忠)
第四节 有机磷酸酯类的中毒与解救
［实验目的］
(1)观察实验动物在有机磷酸酯类中毒时的症状，以及中毒时血液胆碱酯酶活力的抑制情况。
(2)根据阿托品、解磷定对有机磷酸酯类中毒的解救效果及对血液胆碱酯酶活力的影响，分析两药的解毒原理。
［实验动物］
家兔2只，性别不拘。
［药品、器材］
30％精制敌百虫溶液、0.2％高级职称考试网硫酸阿托品溶液、2.5％解磷定溶液、二甲苯。家兔固定箱、注射器、预先加草酸钾的试管、试管架、刀片、干棉球、瞳孔尺与木夹。
［参考指标］
见表4-1。
［方法、步骤］
(1)取家兔2只，以甲、乙编号，称其体重，观察活动情况和呼吸(频率、幅度、是否困难等)
、瞳孔大小、唾液分泌、大小便、肌张力、有无震颤等，分别加以记录。
&nbs执业药师p; (2)将2只家兔分别固定于箱内，以蘸有二甲苯的棉球涂擦耳壳，使血管扩张。
当充血明显时，用刀片切割耳静脉(切口不要过大、过深)，让血液自然流出，滴入预先置有少量草酸钾结晶的试管中，立即摇匀，供测定血液胆碱酯酶活力之用，如取血后切口流血不止，可用干棉球按住，再夹上木夹止血。
(3)将2只家兔同样给予有机磷酸酯类药物。腹腔注射30％敌百虫1.0mg/Kg，密切注意给药后家兔各项生理指标的变化，加以记录，中毒症状明显后，再按上述方法取血，留待胆碱酯酶活力测定。
(4)立即给甲兔由耳缘静脉注射0.2％硫酸阿托品溶液1.0 ml／kg，给乙兔由耳缘静脉注射2.5％解磷定2.0ml／kg，然后每隔5min，再检查各项生理指标1次，观察2只家兔的情况有无好转，特别注意甲兔和乙兔的区别。待有关中毒症状明显消减以后，再由2只家兔的静脉取血，测定血液胆碱酯酶活力。
实验结果按表4-1的内容逐项填写。
表4-1 有机磷酸酯类中毒与解救的实验结果
| 兔号 | 体重（kg) | 用药情况 | 瞳孔（mm) | 唾液 | 呼吸 | 大小便 | 肌张力 | 震颤 | 结果 |
| 甲 | 用药前敌百虫阿托品 | ||||||||
| 乙 | 用药前敌百虫解磷定 |
［注意事项］
(1)敌百虫属于剧毒类杀虫剂，且可从皮肤吸收，如与手等接触后，应立即用水清洗。
(2)给家兔实施腹腔注射敌百虫后，15min时仍未出现中毒症状，可再追加1／3剂量的敌百虫溶液。
(3)本实验为分析阿托品和解磷定的作用机制而设。应切记，在临床实际中，须将阿托品与解磷定配合使用，才能获得最好的解毒效果。
［思考题］
试根据本次实验结果，分析有机磷酸酯类的中毒机制及阿托品和解磷定的解毒原理。
附：全血胆碱酯酶活力的比色测定法
一、原理
血液胆碱酯酶催化乙酰胆碱的水解。在一定条件下，水解的乙酰胆碱量与酶的活力有关。故加入一定量的乙酰胆碱，使之与血液作用后，测定剩余乙酰胆碱之量，便可知已水解的乙酰胆碱量，从而测出胆碱酯酶的活力。
剩余乙酰胆碱的测定是利用乙酰胆碱与羟胺作用生成羟肟酸，后者在酸性条件下又与三价铁离子作用，生成红棕色的羟肟酸铁络合物。
二、器材
试管、试管架、吸管、恒温水浴、光电比色计。
三、试剂
(1)2／15mol／L磷酸氢二钠溶液：称取Na2HPO4·12H2O 23.87g，用蒸馏水溶解并稀释至500m1。
(2)2／15mol／L 磷酸二氢钾溶液：称取KH2P04 9.08g，用蒸馏水溶解并稀释至500 ml。
(3)pH7.2磷酸盐缓冲液：取2／15 mol／L磷酸氢二钠溶液72ml，与2／15mol／L磷酸氢二钾溶液28ml混和即成。
(4)0.1mol／LpH4.5醋酸盐缓冲液：先由每升冰醋酸5.78m1之水溶液28ml和每升含醋酸钠(不含结晶水)8.20g之水溶液22ml混和，成为0.1 mol／L pH4.5之醋酸盐缓冲液，再用蒸馏水稀释到l／100倍。
(5)0.07mol/L乙酰胆碱底物贮存液：快速称取氯化乙酰胆碱0.127g(或溴化乙酰胆碱0.158g)，溶于0.001mol／L PH4.5醋酸盐缓冲液10m1中。在冰箱中可保存4周。
(6)0.007 mol／L乙酰胆碱底物应用液：临用前取0.07 mol／L乙酰胆碱底物贮存液，用pH7.2磷酸盐缓冲液稀释到1／10倍。
(7)碱性羟胺溶液：临用前20分钟内取等量的14％氢氧化钠溶液和14％盐酸羟胺溶液，混和即成。
(8)33.3％(V／V)盐酸溶液：取比重为1.18的盐酸50ml，加蒸馏水100ml。
(9)10％三氯化铁溶液：称取FeCl3·6H2O 10g，用0.1 mol／L 盐酸溶解，使成100ml。
四、实验方法
按表4-2进行操作，每加一种试剂后均须充分摇匀，保温时间须严格控制。
表4-2 比色测定法的实验操作步骤
| 步骤 | 操 作 | 标准管(m1) | 测定管(m1) | 空白管(m1) |
| 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 | pH7. 2磷酸盐缓冲液 全血 37℃水浴预热3min 乙酰胆碱底物应用液 37℃水浴预热20min 碱性羟胺溶液 乙酰胆碱底物应用液 室温静置2min 33.3％盐酸溶液 10％三氯化铁溶液 | 1.0 0.1 1.0 4.0 — 2.0 2.0 | 1. 0 0.1 1.0 4.0 — 2.0 2.0 | l.0 0.1 — 4.0 1.0 2.0 2.0 |
用滤纸过滤，于15min内用分光光度计比色，在525nm处比色，以空白管校正光密度到0点，读取各管吸光度计算
标准管吸光度—测定管吸光度=全血ChE活力单位数
标准管吸光度
注：以1m1血液在规定条件下能分解lμmo1乙酰胆碱为1个胆碱酯酶活力单位。
(黄红林 谢志忠)
