卫生毒理学电子教材-第八章 外来化合物的生殖发育毒性及其评价:第三节 发育毒性及其评定

（一)发育毒性

某些外来化合物可干扰胚胎以及胎儿的发育过程，影响正常发育。具体表现可分为：

1．生长迟缓。即胚胎与胎仔的发育过程在外来化合物影响下，较正常的发育过程缓慢。

2．致畸作用。由于外来化合物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种器官表现形态结构异常。致畸作用所表现的形态结构异常，在出生后立即可被发现。

  3．功能不全或异常。即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常。功能不全或异常往往在出生后一定时间才被发现，因为正常情况下，有些功能在出生后一定时间才发育完全。

 4．胚胎或胎仔致死作用。某些外来化合物在一定剂量范围内，可在胚胎或胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。具体表现为天然流产或死产、死胎率增加。在一般情况下，引起胚胎或胎仔死亡的剂量较致畸作用的剂量为高，而造成发育迟缓的剂量往往低于胚胎毒性作用剂量，但高于致畸作用的剂量。

致畸作用是外来化合物发育毒性的一种具体表现，对存活后代机体影响较为严重，往往是一种不可逆过程。有些文献中将致畸作用称为发育毒性，可以理解为发育毒性的侠义概念。

   （二)畸形、畸胎和致畸物

  器官形态的异常称为畸形。

  具有畸形的胚胎或胎仔，称为畸胎。

  凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化合物称为致畸物或致畸原。

     （三)胚胎毒性作用

    外来化合物引起的胎仔生长发育迟缓和功能缺陷不全的损害作用。其中不包括致畸和胚胎致死作用。

   （四)母体毒性作用

  母体毒性作用是指外来化合物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用。具体表现包括体重减轻、出现某些临床症伏、直至死亡。母体毒性作用可分为轻度和严重母体中毒。轻度母体中毒的表现应限于母体体重下降，正常增长受到抑制。抑制程度，不超过不接触受试物对照组动物的10%。肝重可略有增加，但生殖机能正常；严重母体中毒可出现体重增长大幅度抑制、持久性呕吐、过度安静或活动过度、呼吸困难、生育机能明显受损及其它中毒症状，甚至死亡。

   （五)母体毒性作用与致畸作用关系

外来化合物的母体毒性作用与致畸作用的关系有下列几种：

1. 具有致畸作用，但无母体毒性出现。表明此种外来化合物的致畸作用具有特定的作用机理，与母体毒性无关。此种受试物致畸作用往往较强，应特别注意。

2．出现致畸作用的同时也表现母体毒性。此种受试物可能既对胚胎有特定的致畸机理，同时也对母体具有损害作用，但二者并无直接联系。

3．不具有特定致畸作用机理，但可破坏母体正常生理稳态，以致对胚胎具有非特异性的影响，并造成畸形。

4．仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。

5．在一定剂量下，既不呈现母体毒性，也未见致畸作用。此种情况并不能确定受试物确实不具致畸作用。可能是动物接触的剂量未达到致畸作用的最小有作用剂量，即致畸阈剂量，并非真正不具有致畸作用。在对一种外来化合物进行致畸试验时，如未观察到致畸作用，也无母体毒性表现，应在动物可能耐受条件下，最大限度地增加剂量，使其远远高于人类实际可能接触的水平，如仍未出现致畸作用，才可做出结论。

（一)器官发生期的胚胎对致畸物最为敏感

具有发育毒性的外来化合物与发育中的胚胎或胎仔接触，可因胚胎或胎仔所处的发育阶段不同而呈现不同的敏感性。有性生殖动物由受精卵发育成为成熟个体的过程，可概括为胚泡形成、着床、器官发生、胎儿发育以及新生儿发育等阶段。着床前的胚胎对胚胎致死作用较为易感，对致畸作用并不如此。在胚胎发育后期和新生儿期，最容易表现的发育毒性是生长迟缓和神经、内分泌以及免疫系统机能的改变。胎仔或胎儿对胚胎致死作用的易感性虽较胚胎为低，但仍有一定数目的死产胎发生。

在致畸作用中，对致畸物最敏感的阶段是器官发生期，一般称为危险期或关键期。在常用试验动物中，自受精日计算，大鼠器官发生期约为9～17天，小鼠器官发生期为7.5～16天，家兔为11～20天。在器官发生期中，致畸物与胚胎接触可能造成形态结构异常，但如在着床前胚泡形成阶段接触致畸物，则往往出现胚胎死亡，畸形极少。大鼠着床前胚泡形成期，自受精日计算，约为3～4天，开始着床日约为5.5～6天；小鼠分别为3～4天和4.5～5天；家兔分别为3～4天和7天。

同一剂量的一种致畸物在敏感期中与胚胎接触，可因胚胎所处发育阶段不同而出现不同的畸形。例如，以20mg/kg体重剂量环磷酰胺在受精后第8～12天期间，每日分别给予小鼠，虽然畸形多出医学三基现于前肢趾部，但畸形种类，则可因给予的日期不同而分别为多趾，并趾，缺趾和无趾。如将大量维生素A在受精后第8天给予大鼠，主要出现骨骼畸形；如在第12天给予，则诱发腭裂。同样剂量砷酸钠在小鼠受精第7天和第9天分别给予，前者主要出现脐疝，后者主要为露脑。

发育中的胚胎对致畸作用的敏感期虽然主要在器官发生期，但在此期间，各种不同器官还各有特别敏感的时间。大鼠器官发生期为受精后9～17天，但眼的最敏感期为受孕后9天，心脏和主动脉弓约为9～10天之间，脑约为10天，头与脊椎骨约为11天，腭为12～13天，泌尿生殖器官约为15天。

   （二)剂量与效应关系较为复杂

1．  剂量效应关系复杂的表现及原因是：

   （1)机体在器官形成期间，与具有发育毒性的化合物接触，可以出现畸形，但也可引起胚胎致死。当剂量增加时，毒性作用增强，但二者增强程度并不一定成比例，往往胚胎致死作用增强更较明显，而致畸作用并不如此。由于胚胎死亡增加，畸胎数将因而减少。

   （2)某种致畸物可以引起一定的畸形，但在同一条件下，给卫生资格考试网予更高的剂量，并不出现同一类型畸形。可能由于较高剂量往往造成较为严重的畸形，较低剂量一般引起的轻度畸形，而严重畸形有时可将轻度畸形掩盖。例如一种致畸物在低剂量时，可以诱发多趾，中等剂量时则诱发肢长骨缩短，高剂量时可造成缺肢或无肢。

   （3)许多致畸物除具有致畸作用外，还有可能同时出现胚胎死亡和生长迟缓；而且不同表现还可以相互影响，又无一定规律。

2．致畸作用的剂量反应曲线较为陡峭   最大无作用剂量与100%致畸剂量之间距离较小，一般相差1倍，曲线斜率也较大。往往100%致畸剂量即可出现胚胎死亡，剂量再增加，即引起母体死亡。还有人观察到致畸作用最大无作用剂量与引起100%胚胎死亡的最低剂量仅相差2～3倍。例如剂量为5～10mg/kg体重的环磷酰胺给予受孕小鼠不表现致畸作用，但增加到40mg／kg体重，可引起100%胚胎死亡。

过低剂量不足以显示确实存在的致畸作用，可得出错误的结论；剂量过高可使大量胚胎死亡或对母体毒性作用过强，都可影响结果的正确性。另外，评定一种致畸物对人体危害时，应充分考虑人体可能实际接触的剂量。

   （三)物种差异以及个体差异在致畸作用中较为明显

任何外来化合物的损害作用都存在物种以及个体差异，但在致畸作用中更较突出。同一致畸物在不同动物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的类型也不一致。例如，杀虫剂西维因对豚鼠具有致畸作用，对家兔和仓鼠并不致畸。农药二嗪农和除草剂草完隆对豚鼠与家兔致畸，但对仓鼠未见致畸作用。反应停对人类以及其它灵长类动物具有强烈致畸作用，但对小鼠和家兔即使接触较大剂量，其致畸作用仍极为轻微。

种间差异既同一物种中不同品系之间存在的差异，在致畸作用中也极明显。同一物种动物的不同品系对一种致畸物敏感性的差别很大。例如，脱氢皮质酮和生物染料锥虫蓝以及反应停都有这种现象。

致畸作用是发育毒性中最重要的一种表现，所以外来化合物发育毒性的评定，主要是通过致畸试验。在致畸试验中除可观察到出生幼仔畸形外，也可同时发现生长发育迟缓和胚胎致死。传统常规致畸试验是评定外来化合物是否具有致畸作用的标准方法，多年来很多国家和机构都采用和推荐这一方法。

   （一)传统常规致畸试验（致畸试验)

1．动物选择

致畸试验的动物选择，除参照毒性试验中选择动物的一般原则，即食性和对受试物代谢过程与人类接近，体型小，驯服，容易饲养和繁殖及价廉外，还应特别注意妊娠过程较短、每窝产仔数较多和胎盘构造及厚度与人类接近等特点。

  根据上述原则综合考虑，致畸试验可选用二种哺乳动物，一般首先考虑大鼠，此外可采用小鼠或家免。大鼠受孕率高，每窝产仔8～10只，易于得到足够标本数；而且经验证明，大鼠对大多数外来化合物代谢过程，基本与人类近似，故可首先考虑。但大鼠对一般外来化合物代谢速度，往往高于小鼠和家兔，以致对化学致畸物耐受性强、易感性低，有时出现假阴性。大鼠在器官发生期初期，其胎盘具有卵黄囊，称为卵黄囊胎盘，在器官发生期后期，将转变为绒膜尿囊胎盘，有些外来化合物，例如锥虫蓝可以干扰通过卵黄囊胎盘对胚胎的正常营养过程，并因此致畸，出现阳性结果；而人类胎盘不具有卵黄囊胎盘阶段，不存在同样问题，所以有时此种结果对人类为假阳性。

小鼠自然畸形发生率较大鼠高，但低于家兔，对形成腭裂的致畸物更较敏感。家兔为草食动物，与人类代谢功能差异较大，妊娠期不够恒定，有时延长至36天，自然畸形发生率也较高。

2．剂量分组

由于致畸作用的剂量效应（反应)关系曲线较为陡峭，斜率较大，最大无作用剂量与引起胚胎大量死亡以及母体中毒死亡的剂量极为接近。因此在确定剂量时，一方面要求找出最大无作用剂量以及致畸阈剂量；同时还要保持母体生育能力，不致大批流产和过多胚胎死亡；较多母体死亡也应避免。

一般应先进行预试，预试的目的是找出引起母体中毒的剂量。

根据预试结果可以确定正式试验剂量。应最少设3个剂量组，另设对照组。原则上最高剂量组，可以引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超过10%。最低剂量组不应观察到任何中毒症状；中间剂量组可以允许母体出现某些极轻微中毒症状。其剂量与高剂量和低剂量成等比级数关系。

一般最高剂量不超过LD₅₀的1/5～1/3，低剂量可为1／100～1／30。这一原则在预试中也可试用。如已掌握或能估计人体实际接触量，也可将实际接触量作为低剂量，并以其10倍左右为最高剂量。凡急性毒性较强的受试物，所采用剂量应稍低，反之可较高。也有人以亚慢性毒性试验的最大无作用剂量为高剂量，并以其1／30为低剂量，可供参考。

每组动物大鼠或小鼠为12～20只，家兔8～12只，狗等大动物3～4只。在一般常规试验中，除设有3个剂量组和一个对照组外，如受试物溶于某种溶剂或介质中给予动物，则另设溶剂对照组。有时为了更好地验证试验结果，另设阳性对照组，按大鼠每kg体重15 000IU维生素A剂量，或将每ml含50 000IU维生素A的浓鱼肝油，按每100g体重1 ml剂量给大鼠灌胃。此外敌枯双、五氯酚钠等也可采用。

3．动物交配处理 

将性成熟雌雄动物按雌雄l：1或2：1比例同笼交配。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。确定受孕方法是阴栓检查或阴道涂片精子检查。出现阴栓或精子之日即为受孕0日，也有人作为第1日。准确确定受孕日对精确掌握动物接触受试物时间、最后处死动物及确定进行检查的日期非常重要。

 由于致畸作用有极为明确的敏感期，应精确掌握动物接触受试物的时间，必须在器官发生期。如提前在着床前接触，将影响受精卵的着床。如在胚胎发育的最初阶段，例如裂卵期和囊胚期接触受试物，往往可使胚胎死亡，不能造成畸形。如在器官发生期以后接触受试物，则各种器官已发育成熟，致畸作用不易表现。只有器官发生期的胚胎，对致畸物最为敏感，易于出现畸形。

大鼠和小鼠一般可自受孕后第5天开始给予受试物，每日一次，持续到第15天。如拟深入研究何种器官对受试物更为易感，则应在上述期间将受试物每日分别给予一批动物，每批动物只接触受试物一次，最后可以根据畸形出现的情况，确定受试物的主要靶器官。

  接触受试物的方式与途径应与人体实际接触情况一致，一般多经口给予。也可采用灌胃方式，以保证剂量准确，效果较混入饲料喂给为好。在特殊情况下，也可采用腹腔注射法，效果与经口近似。

  试验期间每2～3天称取母鼠体重。一方面可根据体重增长，随时调整给予受试物的剂量，同时也可观察受孕动物的妊娠情况和胚胎发育情况。受孕动物的体重如持续增长，则表示妊娠过程及胚胎发育正常；如体重停止增长或下降，可能由于受试物的毒性作用或母体的其它原因，引起胚胎死亡或流产。

4．胎仔检查

自然分娩前1～2日将受孕动物处死，剖腹取出子宫及活产胎仔，并另行记录死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19～20天，小鼠第18～19天，家兔在第29天。

活产胎仔取出后，先检查性别，逐只称重，并按窝计算平均体重，然后由下列几方面进行畸形检查：①外观畸形肉眼检查，例如露脑；②肉眼检查内脏及软组织畸形，例如腭裂；③骨骼畸形检查，例如颅顶骨缺损，分叉肋等。畸形检查只限活产胎仔。

以上检查只能检出结构与形态异常的畸形，不能检出可能发生的生化功能或神经行为缺陷。因此有人主张将试验雌鼠保留1/4左右，待其自然分娩，并将出生幼仔饲养观察，至少到断奶，以便检查可能存在的先天缺陷和生理功能异常。

5．结果评定

在致畸试验结果评定时，主要计算畸胎总数和畸形总数。计算畸胎总数时，每一活产幼仔出现一种或一种以上畸形均作为一个畸胎。计算畸形总数时，在同一幼仔每出现一种畸形，即作为一个畸形；如出现二种或二个畸形，则作为二个畸形计，并依此类推。计算时还要对剂量效应（反应)关系加以分析。更重要的是按下列指标将各剂量组与对照组结果进行比较。

（1)活产幼仔平均畸形出现数： 即根据出现的畸形总数，计算每个活产幼仔出现的畸形平均数。对较为重要的畸形，还可分别单独进行计数。

     畸形总数

   活产幼仔平均畸形出现数= ———————————

活产幼仔总数

（2)畸形出现率：即作为畸胎的幼仔在活产幼仔总数中所占的百分率。

     出现畸形的胎仔总数

  畸胎出现率= ———————————  × 100%

活产胎仔总数

   （3)母体畸胎出现率：即出现畸形胎仔的母体在妊娠母体总数中所占的百分率。计算出现畸形母体数时，同一母体无论出现多少畸形胎仔或多少种畸形，一律按一个出现畸胎的母体计算。

   出现畸胎的母体数 

  母体畸胎出现率= ———————————× 100% 

妊娠母体数

6．致畸物以及发育毒性作用物危险度评定

   （1)欧共体（EEC)和经济合作与发展组织（OECD)建议的致畸物分级标准。主要根据动物试验和人群调查资料，具体分级标准：

1级， 已确定人类母体接触后可引起子代先天性缺陷；

2A级，对动物肯定致畸，但对人类致畸作用尚未确定因果关系；

2B级，动物试验结果肯定致畸，但无人类致畸资料；

3 级，尚无结论性肯定致畸证据或资料不足；

    4级， 动物试验阴性，人群中调查结果未发现致畸

  （2)致畸指数： 母体LD₅₀与胎仔最小致畸作用剂量之比，即母体LD₅₀／胎仔最小致畸作用剂量。这一比值愈大，致畸作用愈强，一般认为比值10以下者，不具致畸作用，10～100具致畸作用，100以上致畸作用强烈。

  （3)相对致畸指数（RTI)：成年动物最小致死剂量（LD₀₁)与引起5%活产胎仔出现畸形的剂量（tD₀₅)之比值，即LD₀₁／ LD₀₅。