卫生毒理学-实验指导:实验四小鼠精子畸形试验

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卫生毒理学:实验指导实验四小鼠精子畸形试验:◎<一目的>◎<二　原理>◎<三　仪器及试剂>◎<四　实验步骤>◎<五　统计方法及结果判定>※<一目的>掌握小鼠精子畸形试验的基本技术　　返回顶部※<二　原理>　　小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遗传性，许多常染色体及X、Y性染色体基因直接或间接地决定精子形态。精子的畸形主要是指形态的异常，已知精子的畸形是决定精子形成的基因发生突变的结果。因此形态的改变提示有关基因及其蛋白质产物的改变。小鼠精

◎<一目的> ◎<二　原理> ◎<三　仪器及试剂> ◎<四　实验步骤> ◎<五　统计方法及结果判定>

※<一目的>

掌握小鼠精子畸形试验的基本技术

　　

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※<二　原理>

　　小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遗传性，许多常染色体及X、Y性染色体基因直接或间接地决定精子形态。精子的畸形主要是指形态的异常，已知精子的畸形是决定精子形成的基因发生突变的结果。因此形态的改变提示有关基因及其蛋白质产物的改变。小鼠精子畸形试验可检测环境因子对精子生成、发育的影响，而且对已知的生殖细胞致突变物有高度敏感性，故本试验可用作检测环境因子在体内对生殖细胞的致突变作用。

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※<三　仪器及试剂>

　　全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为蒸馏水。
　　3.1　实验室常用设备。
　　3.2　生物显微镜。
　　3.3　甲醇。
　　3.4　1%～2%伊红染色液：称取伊红1～2g，溶于100mL蒸馏水备用。

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※<四　实验步骤>

　　4.1　动物
　　6～8周龄(体重25～35g)。
　　4.2　剂量分组
　　设一个阴性对照(溶剂)组，一个阳性对照组及三个试验组，每组至少有5只存活动物。阳性物可采用环磷酸胺40～60mg/(kg·d)或甲基磺酸甲酯(MMS)50mg/(kg·d)，丝裂霉素C(MMC)1.0～1.5mg/（kg·d)。最高剂量可取最大耐受量，或分别取1/2、1/4和1/8LD₅₀作为剂量组。经口给予，连续5d。
　　4.3　操作步骤
　　4.3.1　动物处死时间：各种会计资格致突变物作用于精子的不同发育阶段，可在接触某种致突变物后不同时间出现精子畸形，故有条件时，可给于受试物后第一、四、十周处死动物，检查精子形态。因为大部分化学致突变物对精原细胞后期或初级精母www.lindalemus.com/hushi/细胞早期的生殖细胞较为敏感，故一般均是于首次给受试物后的第35d处死。
　　4.3.2　用颈椎脱臼法处死小鼠，取出二侧副睾，放入盛有适量生理盐水(1mL)的小烧杯中或放入盛有2mL生理盐水的平皿中。用眼科剪将副睾纵向剪1～2刀，静止3～5min，轻轻摇动。用四层擦镜纸或合成纤维血网袋过滤，吸滤液涂片。空气干燥后，用甲醇固定5min以上干燥。用1%～2%伊红染色1h，用水轻冲，干燥。
　　4.3.3　镜检：在低倍镜下(用绿色滤光片)找到背景清晰精子重叠较少的部位，用高倍镜顺序检查精子形态，计数结构完整精子。精子有头无尾(轮廓不清)或头部与其他精子或碎片重叠，或明显是人为剪碎者，均不计算，每只动物至少检查1000个精子。
　　精子畸形，主要表现在头部，其次为尾部，畸形类型可分为无钩、香蕉形、胖头、无定形、尾折叠、双头、双尾等。异常精子均应记录显微镜的坐标数，以备查询。并分别记录异常类型，以便统计精子畸形率及精子畸形类型的构成比。
　　判断双头、双尾畸形时，要注意与二条精子的部分重叠相鉴别，判断无定形时要与人为剪碎及折叠相鉴别。

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※<五　统计方法及结果判定>

　每个剂量组应分别与相应的阴性对照组进行参数统计方法比较，如用Wilcoson秩和检验法评价精子畸形阳性的标准是，畸形率至少为阴性对照组的倍量或经统计有显著意义，并有剂量反应关系。
　　一般阴性对照组的精子异常率为0.8%～3.4%，供参考。但应有本实验室所用实验动物的自发畸形率作参考。

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