卫生毒理学-实验指导:实验动物生物标本收集及处死

 1．血液采集  终末和非终末采血技术(如麻醉，取血体积)是有区别的，在以动物死亡为实验结束(终末实验)时的情况下采血与在清醒动物身上单次或多次采血的情况是迥然不同的。

在实验过程中减少动物的疼痛与不安和获得预期实验结果一样重要。这不仅是出于人道主义，而且也是良好科学实践所要求的内容。因某一特定采血技术的动用和由此给动物带来的不安可能会使动物产生应激，而伴随应激反应出现的许多生化和生理改变会影响实验结果，如血中儿茶酚www.lindalemus.com/yaoshi/胺类、催乳素和糖皮质激素的升高会影响葡萄糖、红细胞数、白细胞数和细胞压积等一些代谢参数。所以如果不能完全排除应激，那么也应将应激降至最小程度．这不只是为动物考虑，也是为获得有代表性数据的良好科学实验所需。

在非终末采血中；不要抽血太多，因为取血过多会减少总血量而导致错误结果．总血量的减少会伴随血红蛋白含量、氧转运能力和血压的下降及应激相关激素浓度的升高，也可能进一步产生其他变化，如胃粘膜坏死等。

血液总量取决于物种、性别、年龄、健康及营养状况。对于同一种物种，较大动物单位体重的总血量比较小的动物要少，老龄和肥胖动物比年轻和正常体重的动物单位体重含总血量少。一般情况下，总循环血量为55~77mI／kg体重。

非终末采血可分为单次和多次采血，单次采血量低于动物总血量的15%，对动物不会有影响。然而，若取量为总血量的15%～20％，则会出现一些副作用，如心排血量或血压降低。如果取总血量的30％一40%则会引起缺血性休克，若取血达40％可引起约50％的猪和大鼠死亡。

康的没有明显不良反应的动物，单次采血不超过动物总血量的15%，可在3—4周居重复采血。多次采血每24h不应超过总血量的1%[o．6 mi／(kg，d)]，若采集次数和(或)采血量过多则引起贫血。

对大、小鼠采取不超过o.1ml的毛细管中血液常用尾尖果血法．眼眶静脉丛穿刺通常适用于无尾动物如仓鼠。当尾静脉不能满足较大的采血量时，大/小鼠也可用此技术．一般要求在麻醉下操作。只有当没有别的方法的特殊情况下，2周后才能考虑用动物恢复的眼眶静脉丛再次取血。这项技术应由训练良好的工作人员来操作，而且只能用动物的一只眼睛．不赞成在无麻醉条件下，用眼球摘除法取血。

在毒物动力学研究中，大鼠采血可采用；尾静脉、趾脉管系、全麻下心脏穿刺、全麻下外颈静脉和总颈动脉插管。

兔和豚鼠可用耳绕静脉、颈静脉或隐静脉。较大动物的采血可从浅表静脉进行(隐静脉、头静脉、颈静脉)。

2．尿液采集  大鼠和小鼠可用代谢笼，下部有粪尿分离铝。在毒物动力学研究中，对半减期长(数小时以上)的受试化学物可用代谢笼，对半减期短的受试化学物可在全麻下经尿道或经腹壁插管至膀胱收集尿液。对犬可用接尿法或导尿法．

  3．胆汁采集  在毒物动力学研究中，可直接插管至总胆管，其尖端应接近肝门区的分叉点．大鼠胆汁一般达0.5－1.0ml。插管后应立即给以受试化学物，因为胆盐不能再循环时，胆汁的成分就会改变。对有胆囊的实验动物(如豚鼠和兔)，应在胆囊基底部结扎胆囊，以防止胆囊延缓经胆汁消除。

4．粪便采集  大鼠和小鼠可用代谢笼，下部有粪尿分离器粪，分析前剃去表层，取内层粪分析．

 在麻醉过程中，必须对动物仔细观测。所用技术设备应可对多个系统进行检查，如循环系统(心率、脉搏、血压”心电图、外周灌流量、体温)或呼吸系统(呼吸频率)。在麻醉程中确定麻醉深度是一个非常重要的步骤。麻醉分为四个时期。

(1)痛觉丧失期(从药效开始发挥到意识丧失)。

(2)兴奋期t从意识丧失开始出现到规则呼吸结束。呼吸不规则，瞳孔扩大，运动反射增强，眼球震颤，角弓反张．

(3)耐受期，从规则呼吸开始到自主呼吸结束。这个时期又分为四段；①规则呼吸，瞳孔缩小，多数反射出现；②骨骼肌松弛，瞳孔缩小，眼睑反射消失，角膜反射出现，呼吸平稳，痛觉缺失，是进行手术的最佳麻醉状态，③只有角膜反射，呼吸非常困难，瞳孔扩大，④没有反射，砰吸非常平稳，瞳孔扩大。

 (4)窒息期：反射性脯呼吸结束之后毒剂防止死亡。

应用乙醚时上述各期出瑰较为明显应用时)，动物的反应会和上述有所不同没有反射，没有呼吸，濒临死亡，需立即使用解毒剂

进行手术的最佳麻醉状态是意识丧失，痛觉丧失和松弛．对不同物种、根据麻醉的持续时间，常将短效(30min)、中效(120m[n]、长效(长于120min~,麻醉剂联合用药。

在麻醉时和麻醉后必须检查动物的体温，当体温降低时，要使用加热灯、加热垫．在醉终止后动物要经历和麻醉过程相同但顺序相反的几期(耐受期、兴奋期、痛觉丧失

常用的麻醉药物：

(1)短效：对啮齿类多用乙醚，对大动物可用硫喷妥钠10～25mg／kg静脉或腹腔注

 (2)中效，推荐用赛拉嗪+氯胺酮，对啮齿类5＋100mg／kg肌内注射，对大动物2+tag／kg肌内注射。

  (3)长效；常用戊巴比妥钠，对啮齿类35～50mg／kg腹腔注射，对大动物30mg／kg静脉或腹腔注射，对大鼠还可用乌拉坦1500rug／k8肌内注射．

安死术(euthanama)是指用公众认可的、以人道主义的方法处死动物的过程，即达到有惊恐或焦虑而安静地、无痛苦地死亡．安死方法的最重要性的标准是：安死术应具有证动物中枢神经系统立即达到失去痛觉的早期抑制作用．选择哪种安死术必须根据待死动物的感觉能力而不是根据实验观察者或操作者的主观www.lindalemus.com/shouyi/感觉，尽管后者是不容忽视．因此断头术或放血致昏法还不失为人道主义的安死术。安乐死的方法对动物的物种年龄应是适宜的，而且应是无痛苦，不引起兴奋，能快速导致意识丧失和死亡．此外，方应是可靠、可重复和不可逆的。

建议在实施任何安死术前；对犬、猫及大型动物，都应使用镇静剂。如果可能，即将处死的动物不应和其他动物在同一个房间里，特别是当用比较残忍的方法时，如断头法。

安乐死之后，确认动物死亡非常关键。死亡症状有心跳、呼吸停止，反射缺失。可通过放血或取出心脏，毁损大脑，断头，切除内脏，出现尸僵等来确保动物死亡。 

毒性病理学检查是毒理学试验重要的组成部分，病理学研究有助于确定有害作用和器官。毒性病理学检查包括大体解剖和组织病理学检壹两部分。急性毒性试验中在试期中死亡或试验结束处死的动物都应进行尸体解剖，因为急性毒性试验的目的是得到有关可能的靶器官以及进行重复染毒试验剂量设计的信息。在亚慢性、慢性、致癌试验病理学是一个重要的终点。

1．大体解剖  在实验动物处死后半小时内进行，解剖方法采厨胸腔，腹腔脏联合取出法。应观察有关脏器的外形和表面情况、颜色、边界和大小、质地、切面．对指定自器称重，并计算脏器系数。

   2．组织病理学检查  对指定的器官或组织用锋利的刀剪取材，应统一取材部位。组织块一般在10倍体积的10％福尔马林液中固定，此后常规制片(组织石蜡包埋、切HE染色)。应详细记录显微镜下观察到的病变，并做出病理诊断。必要时，请其他病理学家对有疑问的或有争论的发现进行复查．利用特殊染色、组织化学及电子显微镜技术可有助于毒作用机制的研究。