实验二十一 螺旋体
螺旋体(spirochete)是一类细长柔韧、弯曲呈螺旋状、具有轴丝、运动活泼的原核细胞型微生物。用革兰染色法染色时不易着色。螺旋体种类多，除钩端螺旋体(简称钩体)外皆不易在人工培养基上生长。大多数为非致病性螺旋体，仅少数对人和动物有致病性。对人类致病的主要有钩体(图21-1)、梅毒螺旋体(图21-2)、回归热螺旋体(图21-3)和伯氏疏螺旋体。
图21-1 钩端螺旋体属镜下形态(暗视野) 图21-2 梅毒螺旋体镜下形态(暗视野)
图21-3 回归热螺旋体镜下形态(Giemsa染色)
一、钩端螺旋体
（一)形态观察
【材料与方法】
钩体暗视野显微镜观察 取钩体培养液，滴于载玻片上，覆以盖玻片。在暗视野显微镜聚光器上加1滴香柏油，使载玻片背面与油接触，低倍镜下调动反光镜，使光集中在聚光器上，调清楚视野再换高倍镜观察。
【结果】
1．药品数据在黑色背景中可清楚地见到闪烁光亮的螺旋体，一端或两端弯曲呈钩状，运动活泼。
2．镀银染色深，钩体染成棕色，菌体粗，有钩，细密螺旋不明显。
（二)人工培养
钩体人工培养较容易，常用柯索夫(Korthof)培养基。在含10%～20%的兔血清培养基中生长良好。温度以28℃左右为宜。一般pH7.2～7.4。需氧。
【材料与方法】
1．取发病1～7d内患者血2～3ml。
2．接种于2～3支柯索夫液体培养基，接种时，血2～3滴/支，血量与培养液成1∶1～20为宜，置28℃培养。
3．从第3d起，每天或数天检查1次。
【结果】
7～10d为钩体繁殖高峰，钩体生长良好者，液体呈雾状浑浊，轻摇培养基,有絮状物泛起。若培养1个月仍无钩体生长则为阴性。
（三)凝集溶解试验
【原理】
凝集溶解试验即活抗原显微镜凝集溶解试验，是目前用得最多的钩体血清学试验之一。钩体与相应抗体结合而发生凝集，抗体浓度高时，可使凝集又发生溶解，故名凝集溶解试验。本试验有型特异性和较高敏感性，可用于临床诊断、钩体血清型鉴定和流行病学调查。
【材料与方法】
1．在有机玻璃凹孔板上，2h后，将各孔分别取1滴于载玻片上，覆以盖玻片，在暗视野显微镜下观察钩体凝集溶解情况(表21-1)。
表21-1 活抗原显凝试验操作方法(定量法)(单位：ml)
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凹孔编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
血清稀释度 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600 对照
稀释血清量 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 盐水0.1
抗原(钩体培养物)0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
血清最终稀释度1:1001:200 1:400 1:800 1:医学.全在线www.lindalemus.com1600 1:3200 1:6400 1:128001:25600 1:51200 －
摇匀，置37℃2h
假定结果 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ ++ + － － －
【结果】
结果判断如下：
++++ 几乎全部钩体溶解，呈团块状或大小不等的残片，间或有少数游离的钩体存在。
+++ 约75％以上的钩体凝集，呈块状或蜘蛛状，约25%钩体游离。
++ 约50％钩体凝集，呈小蜘蛛状，约50%钩体游离。
+ 约25％钩体凝集，75%钩体游离。
- 全部钩体正常，分散，无凝集。
能使抗原发生凝集溶解(++)的血清最高稀释度作为血清抗体效价。病人单份血清效价超过l:400，或双份血清的第2份较第1份有4倍以上增长者，有诊断意义。
二、梅毒的血清学试验
梅毒的血清学试验根据所用抗原不同可分两类。第一类是非螺旋体血清学试验，用正常牛心肌类脂作抗原，检测非特异性的反应素。这一类试验主要有以纯心磷脂、卵磷脂为抗原的方法，即性病研究实验方法(VDRL)及其改良法即血清不加热的反应素试验(unheated serum reagin test，USR)和快速血浆反应素纸片试验(rapidplasma reagin，RPR),有商品试剂供应。USR、RPR法的特异性、敏感性较好，且简便快速，容易在一般实验室推广使用，故最常用于梅毒的普查、筛选，并作为梅毒感染的标准常规诊断方法。第二类为螺旋体血清学试验，是以死的或活的梅毒螺旋体或其成分为抗原检测特异性的抗梅毒螺旋体抗体，即荧光螺旋抗体吸附(fluorescenttreponemal antibody-absorption。FTA-ABS)试验和螺旋体制动试验(treponemal immoblization test，TPI)。第二类试验虽然特异性、敏感性都高，但试验复杂，不易推广，主要用于疑难病例的诊断和鉴别生物学假阳性。
（一)血清不加热的反应素试验(USR)
【原理】
一般认为梅螺旋体感染后，机体组织被破坏而裂解出一种类脂成分，并与梅毒螺旋体蛋白质结合成类脂蛋白复合物，刺激机体产生反应素，这种反应素可与牛心肌类脂发生反应。
【材料】
1．抗原 USR试剂(商品试剂)，置3～10℃可保存6个月。
2．玻片 在玻片上用油漆画直径为14mm圆圈数个。
3．1ml注射器、平面针头：45滴/ml。
4．待检血清标本，不必灭活。
【方法】
1．玻片定性试验
(1)取待检血清0.05ml加在玻片圆圈内。
(2)用1ml注射器加上专用针头，吸取USR试剂后垂直加入，每份标本1滴。
(3)手摇或震荡器摇动玻片4min，每分钟摇动180次左右，在3min内观察完毕。可肉眼直接观察或显微镜观察。
2．玻片定量试验 将原血清作倍比稀释，从1∶2至1∶64，按定性方法操作。
【结果】
++++～+++ 肉眼可见大的或较大的块状物。
++ 可见小块状物，悬液清亮。
+显微镜下为小块状物，均匀分布。
±颗粒不规则分布，或呈细小粗糙物。
-颗粒细小，分布均匀。
（二)快速血浆反应素纸片试验(RPR)
本法是USR的改良法，除具备USR的优点外，患者血清、血浆均可用于试验，由于RPR试剂中加入高纯度的胶体炭，可与阳性血清发生黑色凝块，所以不用显微镜就能准确判断结果。
【材料】
1．抗原 RPR试剂(商品试剂)。
2．RPR试验纸片 每张有12个圈。
3．待检血清标本或血浆标本，不必灭活。
4．1ml注射器，平面针头，60滴/ml。
5．转动器平面转动，100次/min，转动所形成的圆圈直径约2cm。
【方法】
1．血清定性试验
(1)吸取待检血清或血浆0.05ml加在纸板圆圈中，并扩展到整个圆圈。
(2)将RPR悬液摇匀，用注射器吸取后于每个标本上加1滴。
(3)用转动器或手转动纸板8min，为防止蒸发，可在纸板上加盖。
(4)立即在明亮的光线下用肉眼观察结果。为了更好地区分弱阳性与阴性结果，将纸板倾斜与水平面成30°角，作顺时针旋转，使血清与抗原在圆圈内转动，可更清楚地观察反应，必要时可借助于放大镜。
2．血清定量试验 定性试验阳性和弱阳性者，都必须做定量试验。方法是将血清用生理盐水作对倍稀释，从1∶2至1∶32按定性试验操作。若效价高于1∶32，则应测1∶64、l∶128、1∶256稀释度。以最高稀释度达到阳性或弱阳性反应作为效价。
【结果】
阳性反应：可见中等或大凝集块。
弱阳性反应：可见小凝集块。
阴性反应：无块状物或极少数颗粒聚集成粗糙物。
【注意事项】
1．本试验在23℃～29℃室温进行，气温过低或过高都可能影响反应性。试剂及待检血清从冰箱取出后也应在23℃～29℃处放置30min再做试验。
2．作为辅助诊断，试验结果必须结合临床病史、体征、治疗史和流行病学情况进行综合判断。
3．应排除某些疾病引起的生物学假阳性和技术性误差引起的假阳性。生物学假阳性的效价一般不超过1∶8。
4．临床应用时应设阴、阳性对照。
