实验十九 乙型肝炎病毒的微生物学检查
侵犯人体肝脏并致病的肝炎病毒主要有5种，即甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV，或称δ因子)和戊型肝炎病毒(HEV)。HBV属于一类独特的嗜肝病毒(hepadnaviruses)，引起人类乙型肝炎。
通过电镜可直接查找血清中的HBV，通过核酸分子杂交可检查HBVDNA。而检测HBV抗原抗www.lindalemus.com/wsj/体的血清学试验已普遍开展，本实验着重介绍HBsAg等的检测，其他抗原抗体的检测方法与此类似，从略。
一、HBV的免疫电镜检查
通过简易快速的免疫电镜技术(simpleand rapid immune electron microscopy)，SRIM)检测HBV。
【材料与方法】
1．Ag-Ab复合物的制备 将0.1～0.5ml纯化的HBsAg与0.01～0.05ml适当稀释的抗体(视其抗体效价定，一般用1/10)混匀，置37℃水浴30min。
2．浓缩复合物 在2～3层滤纸上放1块厚0.15cm，2.5cm2的1%琼脂糖盐水凝胶块，加1滴Ag-Ab复合物在凝胶上呈水珠状，然后将带有载膜(喷有炭)的电镜铜网倒扣漂浮于液滴上。
3、磷钨酸(PTA)负染 在液滴吸干前用镊子小心取下铜网，面向上置于载玻片上，立即加1滴2%PTA溶液(pH6.5～7.0)，染色1～2min。用滤纸小心吸干多余染液后，立即用电镜观察。
4、电镜观察 在5000～10000倍下，寻找有复合物的部位。然后转高倍观察并照相。
【结果】
可在成堆的复合物中观察到免疫“桥”和HBV颗医学三基粒，可见球形或管形等特有的形态和结构。
二、HBsAg的检测
酶联免疫吸附试验是目前检测HBsAg最常用的方法。
【原理】
采用双抗体夹心法。将特异性抗-HBs吸附于固相载体表面，与加入待检血清中的相应HBsAg结合为Ag-Ab复合物，加入过氧化物酶标记的抗-HBs酶结合物，有酶相应底物存在情况下，产生颜色变化，用肉眼判读或酶标仪测定结果。
【材料】
1．包被液 0.02MpH9.6的碳酸盐缓冲液。
2．洗涤液 0.02M pH7.4的PBS-Tween 20(0.05%)液。
3．酶结合物 用辣根过氧化物酶标记的抗-HBs。
4．酶抗体稀释液 0.01M pH7.4的PBS-Tween20液。
5．酶底物液 邻苯二胺(OPD)10mg溶于pH5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液25ml中，临用前加入30%H2O2 0.12ml。新鲜配制，避光。
6．终止液 2MH2SO4。
7．待检血清、阳性血清、阴性血清。
8．聚苯乙烯微量板、微量移液器、吸头等。
【方法】
1．包被 用包被液稀释抗-HBs为50μg/ml，加入微量板100μl/孔。置4℃过夜后，用洗涤液洗3次，每次3～5min。
2．加样 加入稀释为1/50的待检血清100μl/孔，每个标本作2孔，同时作阳性、阴性和空白对照，置37℃2h洗涤3次。
3．加酶结合物 加入经适当稀释的酶结合物100μ1/孔，置37℃2h洗涤3次。
4．加底物 100μl/孔，避光置37℃20～30min。
5．终止反应 1滴/孔终止液。
【结果】
肉眼判读时，待测孔颜色与阴性对照一样或更浅，判为阴性。若明显加深，呈黄棕色，判为阳性。用酶标仪检测时，可选择单波长450nm(以空白孔校零)或双波长450/630nm，读取各孔OD值。P/N值≥2.1为阳性，<2.1为阴性。P为被检标本OD值，N为阴性对照OD值。阴性对照OD值低于0.05作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。
【注意事项】
1．包被后的板，可用0.5～l.0%牛血清白蛋白封板，能更好避免非特异反应出现。
2．微量板包被洗涤液吸干后，4℃干燥保存,可在3个月内使用。
3．加入待检血清与酶结合物后，置43℃1h或4℃18～22h与37℃2h效果一样。
4．若用pH9.0的Tris-Tween洗涤液，效果优于pH7.4的PBS洗涤液。
5．配制底物液宜用棕色瓶，微量板加入底物后注意避光。
