医学微生物学-实验指导:实验二十六 核酸扩增技术

实验二十六 核酸扩增技术

最常用的核酸扩增方法是聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)。

【原理】

PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，是一种体外扩增特异DNA片段的方法，其特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分三步：①变性：加热使双链DNA解离成单链DNA。②退火：引物和其互补的模板DNA结合形成杂交链。③延伸：在DNA聚合酶的催化下。以引物为起始点的DNA链进行延伸。以上三步为一个循环，每一循环产物可作为下一个循环的模板。数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量扩增，数量可达2×10^6~7拷贝。

【反应成分】

1．引物(primer)是DNA聚合酶启动DNA合成时所必需的一段寡核苷酸。

2．TaqDNA聚合酶。

3．反应缓冲液  PCR反应的缓冲液常用含10～50mmol/LTris·HCl，50mmol/L KCl₂的溶液，聚合反应温度下pH为7.2，但各实验室该缓冲液配方可能不同。

4．dNTPs、模板(靶基因)DNA。

【反应体系】

标准的PCR反应体系：（100μl)

　　 　10×扩增缓冲液  10μl
　　　　　　 Mg²⁺(1.5mmol/L) 6μl
4种dNTP混合物(各200μmol/L)   2μl
　　　　　　 上下游引物(各10～100pmol)　 各2μl
　　　　　　 模板DNA(0.1～2μg)　2～4μl
　 　　　　　Taq DNA聚合酶(2.5u)　 &nbswww.med126.comp;1μl
　　　　　　 加双或三蒸水至  100μl

【扩增流程】

一般PCR扩增流程：

94℃ (预中国卫生人才网变性)　  5min

94℃ (变性)　　 30s～1min

55～60℃  （退火) 30s～1min   30～35次循环

72℃   （延伸)  1～2min

72℃   （终延伸)  5～10min

4℃ （保温)