第四部分 分子微生物学实验方法
基因重组可通过转化、转导、接合、溶原性转换等方式进行。本部分所选的细菌耐药基因的重组实验属转化和接合的范畴。
分子诊断技术是一门新兴的生物科学技术，其最大的优点在于灵敏度高、特异性强，并适用于快速诊断；目前已被广泛用于生命科学的各个领域。主要方法可分为核酸检测和蛋白质检测二大类。本部分主要介绍几种最常用的分子诊断方法。
实验二十三 细菌耐药基因的重组
一、细菌质粒的提取与转化
细菌的子代具有与亲代相同的特征，这由细菌的遗传物质染色体DNA决定。但有些遗传特性是由染色体外的遗传物质—质粒所编码的，如抗药基因即可存在于质粒上。这种特性可以通过质粒的传递，在同种或种属关系相近的细菌间转移，使细菌产生广泛耐药性。
本实验以碱裂法提取耐氨苄青霉素供体菌E·coliTG-1 (Amps)的质粒DNA，并以冰预冷CaCl2溶液处理对氨苄青霉素敏感的受体菌JM109，制备感受态细胞；在42℃短暂热休克作用下，可提高接受外源DNA的效率，从而使JM109接受质粒转为耐氨苄青霉素菌。
【材料】
1．菌种：供体菌E·coliTG-1 (含Amps质粒)；受体菌JM109株。
2．LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸出液，10g/LNaCl，960ml双蒸水；加5M/LNaOH调PH值至7.0；定容至1L，高压蒸汽(1.034×105Pa)灭菌20min备用。
3．STE溶液：0.1mol/LNaCl；10mmol/L Tris·HCl；1mmol/LEDTA，pH8.0。
4．溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖；50mmol/L Tris·HCL，pH8.0；10mmol/LEDTA，pH8.0；高压蒸汽灭菌15min，存于4℃。
5．溶液Ⅱ：(临用时配)0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/L NaOH储存液现用现稀释)；1%SDS。
6．溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾60ml；冰乙酸11.5ml；双蒸水28.5ml；配制成100ml量,4℃冷藏备用。
7．酚∶氯仿(1∶1)液、无水乙醇和70%酒精、含RNA酶的TE溶液(pH8.0)、氨苄青霉素(Amp)250mg/ml、0.1mol/LCaCl2等。
【方法】
1．碱裂法提取质粒DNA：
(1)将供体菌接种入2～5ml含100μg/mlAmp的LB培养基中，37℃摇床培养过夜，使细菌生长繁殖旺盛。
(2)将菌液用移液器移至1.5ml EP管离心，13000rpm离心30s，沉淀菌体。
(3)弃上清，菌体沉淀物加入STE液，使菌体充分悬浮后13000rpm离心30s，吸去培养液,使细菌沉淀尽可能干燥。
(4)加入冰预冷的溶液Ⅰ100μl，剧烈振荡混匀菌液。
(5)加入新配置的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口,快速颠倒EP管5次以混匀内容物，使整个EP管内壁均接触有溶液，冰浴5min。
(6)加入冰预冷的溶液Ⅲ 150μl，温和振荡约10s以混匀溶液，置冰上3～5min。
(7)13000rpm离心5min，将上清液转移至一新EP管，加入等体积的酚∶氯仿(1∶1)液。
(8)混匀溶液后，13000rpm离心2 min，将上清液转移至一新EP管，加入双倍体积无水乙醇沉淀双链DNA。振荡混合，于室温放置2min。
(9) 13000rpm离心5min，小心吸去上清,倒置EP管于纸巾上,以使所有液体流出，加入1ml70%酒精，4℃洗涤沉淀。
(10)13000 rpm离心5min，尽量弃尽管内液体，打开管口室温干燥10min或37℃温箱内置5～10min以尽量除去残留液体。
(11)加入30～50μl含RNA酶(20μg/ml)的TE溶液溶解沉淀，振荡后置-20℃冰箱内保存。
2．感受态细胞的制备：要求无菌操作。
(1)取受体菌JM109接种入5mlLB培养基中，37℃摇床过夜。
(2)取菌液100μl接种至5mlLB培养基中，37℃水浴摇床振摇培养1～2h。
(3)取菌液在波长650nm OD读数在0.75左右即可。
(4)取1.5ml置冰预冷的EP管中，冰浴5min，13000rpm低温离心30s,沉淀菌体。弃上清，倒置管口约1min。
(5)加入500μl冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，轻轻吹打混匀溶液，置冰上5min，再13000rpm低温离心30s，收集菌体。
(6)加入150μl冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，轻轻吹打混匀，即为感受态细菌。冰浴30min后可立即使用，也可置4℃12～24h内使用。
3．质粒DNA的转化：
(1)取制备好的上述感受态细胞150μl轻轻混匀加供体菌质粒DNA10μl，混匀后置冰浴中30min；再42℃热休克90s；冰浴2min后加入800μlSOC培养基37℃水浴摇床振摇培养1h；再取培养液100μl，移入含Amp的LB琼脂平板上，用涂布棒涂布均匀，37℃培养过夜，如有转化成功的受体菌，即可以生长。
(2)对照
未经质粒DNA转化的受体菌100μl，接种于含Amp的琼脂平板上，37℃培养过夜，不应生长，但接种于不含Amp的琼脂平板上，37℃培养过夜，可以生长。
(3)结果判断
因本质粒携带Amp的耐药基因，故通过转化进入受体菌后，可使原来对Amp敏感的受体菌成为耐药菌，可在含有Amp的琼脂平板上生长。
二、细菌间耐药基因的转移－接合
细菌的耐药基因既可通过质粒转化的方式，在亲缘关系相近的细菌间转移；也可在亲缘相近的细菌间通过性菌毛的接触，将耐药菌(供体菌)的耐药质粒基因转移至不耐药的细菌(受体菌)菌体内，使受体菌同样获得与供体菌相似的耐药遗传性状，这种传递遗传基因的方式，称为接合。
【材料】
1．菌种：对链霉素敏感的福氏痢疾杆菌株、对链霉素敏感的大肠杆菌株、对链霉素耐药的大肠杆菌。
2．培养基
(1) 肉汤培养基、肉汤琼脂斜面培养基、SS平板、双糖铁培养基。
(2) 微量www.lindalemus.com/zhicheng/发酵管：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖5种单糖发酵管，蛋白胨水、枸橼酸盐微量管。
(3) 含100μg/ml链霉素SS平板；将配制成的普通SS培养基在烧瓶内煮沸，待冷却至50℃以下时，加入链霉素注射液，使成相应浓度，立即摇匀后倾注平板。
3．诊断血清：福氏痢疾杆菌诊断血清。
4．抗生素：链霉素每安瓿含粉剂1g，用时加注射用水稀释(加4ml注射用水后，每ml含0.25g)。
【方法】
1．将3株细菌分别接种于SS平板上，37℃培养24h，以证明SS平板适宜于上述3株细菌的生长。福氏痢疾杆菌不分解乳糖，菌落为无色透明；大肠杆菌分解乳糖，菌落呈粉红色。在普通SS平板上，3株细菌均生长良好。
2．将3株细菌分别接种于含100μg/ml链霉素SS平板上。结果，敏感的福氏痢疾杆菌、敏感的大肠杆菌不生长；耐药的大肠杆菌能生长，出现粉红色菌落。
3．正式试验(接合)：将3株细菌分别移种于肉汤培养基内，37℃培养12h后，取4份敏感的福氏痢疾杆菌液分别与敏感的大肠杆菌、耐药的大肠杆菌各1份，分别混合于无菌试管内。置37℃，室温或4℃2~3h后，接种于含100μg/ml链霉素的SS平板上，37℃培养18~24h，取出观察结果。结果显示，在接种敏感的氏福痢疾杆菌与敏感的大肠杆菌混悬液的SS平板上无菌落出现；在接种敏感的福氏痢疾杆菌与耐药的大肠杆菌混悬液的SS平板上，出现无色透明与粉红色二种菌落。
4．细菌鉴定：在含100μg/ml链霉素SS国家医学考试网平板上挑选2个无色透明菌落，分别接种双糖管中。37℃培养24h，双糖铁培养基上层仍为红色，下层转为黄色，无动力。然后取双糖铁培养基中的细菌接种葡、乳、麦、甘、蔗5种单糖微量管，及枸橼酸盐、蛋白胨水微量管中，37℃培养24~48h，鉴定其生化特性是否符合福氏痢疾杆菌。再取双糖铁培养基中的细菌，与抗福氏痢疾杆菌诊断血清作玻片凝集试验，观察是否会发生特异性凝集反应。
通过上述步骤鉴定，可以证明：在含100μg/ml链霉素SS平板上新出现的无色透明菌落为获得了耐药基因的福氏痢疾杆菌。
