实验二十二 真菌
真菌(fungus)是真核细胞型微生物,可分为单细胞和多细胞两大类,进行有性繁殖或无性繁殖。其种类繁多,分布广泛,绝大部分为腐物寄生,一些对人类十分有利,如发酵饮食,制造抗生素等;少数可引起人类及动植物病害,需加以防治。
由于真菌有特殊形态和结构,因此形态学诊断有一定价值。真菌一般根据形态结构及培养特性即可分类鉴定。必要时,采用生化反应、血清学试验和动物试验来进行鉴别。
真菌的营养要求不高。通常在含有糖类的沙保(Sabouraud)固体培养基上即可生长。但生长较慢,培养基的pH为酸性,大多数需氧,合适的温度为22~28℃,某些深部致病性真菌在37℃中生长良好。
一、真菌的基本形态与菌落观察
通过对真菌培养物镜下染色标本和菌落的观察,认识真菌的菌细胞,菌丝和孢子及菌落的特征(图22-1、2、3、4、5)。
图22-1 菌丝的形态示意图
(a)单纯菌丝 (b)球拍状菌丝 (c)破梳状菌丝 (d)螺旋状菌丝
(e)结节菌丝 (f)鹿角状菌丝 (g)关节菌丝 (h)假菌丝
图22-2 叶状孢子的形态示意图 图22-3 孢子囊孢子形态示意图
(a)芽生孢子 (b)厚壁孢子 (c)关节孢子
图22-4 大分生孢子的形态示意图 图2医学三基2-5 小分生孢子的形态示意图
【材料与方法】
1.白假丝酵母菌革兰染色 取在沙保斜面培养上经37℃培养5~7d的白假丝酵母菌,制成涂片作革兰染色,高倍或油镜检查。
2.白假丝酵母菌厚膜孢子 在消毒玻片上滴加米粉吐温琼脂或玉黍吐温琼脂少许,将白假丝酵母菌接种在琼脂中央,覆盖玻片,37℃培养2~4d,用高倍镜镜检。
3. 新生隐球菌墨汁标本 将新生隐球菌引起的脑膜炎患者脑脊液(或接种于沙保固体斜面培养物)滴于载玻片上,与1接种环墨汁混匀,盖上盖玻片,四周用树脂密封,高倍镜镜检。
4.菌丝和孢子形态 将融化的沙保培养基少许加于消毒载玻片上,待凝后,将曲霉菌种在琼脂中央,覆盖消毒盖玻片,37℃培养1~2d,室温放24h后,棉兰染色,用低倍或高倍镜观察菌丝与孢子。
(1)有隔菌丝——毛癣菌压片或染色片。
(2)无隔菌丝——毛霉菌压片或染色片。
(3)大分生孢子——石膏样小孢子菌或絮状表皮癣菌压片。
(4)小分生孢子——孢子丝状菌或毛癣菌压片或染色片。
【结果】
菌丝和孢子形态观察
1.可见到革兰阳性单细胞菌体、呈卵圆形,大小不等,染色不均,比葡萄球菌约大2~5倍;可见到假菌丝呈藕节状,丛生的芽生孢子呈圆形或卵圆形。
2.白假丝酵母菌体上出芽伸长可形成假菌丝,在假菌丝紧束点上又附着芽生孢子,一些菌丝顶端可见较大、圆形、壁厚的孢子,称厚膜孢子。
3.在黑暗背景上可见多数发亮的单细胞菌体,呈圆形、大小不等,有透明光亮的肥厚荚膜,细胞壁较厚,有些菌体可见从胞壁伸出的圆形芽生孢子。
4.镜下观察时,注意菌丝分枝、交织,有无分隔,及菌丝的特征性表现,如呈螺旋状、球状、梳状、结节状等。大分生孢子壁厚而大,呈梭状或棍棒状,有数个分隔。小分生孢子则较小,单细胞,呈圆形、卵圆形或梨形等。分生孢子位于菌丝末端,该菌丝称分生孢子柄。
5.菌落观察
(1)酵母型菌落——新生隐球菌菌落。呈浅棕褐色,较大,表面湿润光滑,细腻。无菌丝伸入培养基内,类似一般细菌菌落。
(2)类酵母型菌落——白假丝酵母菌菌落。呈现白色奶油状,较大,表面湿润光滑,细腻。有伸长的芽生细胞所组成的假菌丝伸入培养基内,呈树枝状。
(3)丝状菌落——石膏样小孢子菌、铁锈色毛癣菌,瑾色毛癣苗,许兰氏毛癣菌等在沙保培养基斜面上形成丝状菌落。其共同特征为:带有颜色,菌落可呈棉絮状、绒毛状、粉末状,蜡样等。其正面和背面可显示不同颜色,可看到伸向空间的气生菌丝,伸入到培养基内部的营养菌丝。
二、真菌的培养
大多数真菌营养要求不高,37℃条件(深部真菌)或室温(浅部真菌)条件生长较好,在以上温度条件下均可生长的,称双相菌。厌氧,要求弱酸性(pH4.0~6.0)较高的湿度,生长缓慢,一般需1~2W才长成典型菌落。常用的培养基有沙保培养基、麦芽糖培养基、葡萄糖培养基、玉米粉琼脂培养基及血液琼脂培养基等。真菌小培养可以直接观察到生活状态下真菌的完整结构及发育过程,在鉴定上有重要意义(图22-6)。
图22-6 方块法小培养检查 示意图
(a)培养基划块 (b)待检菌株孵育 (c)镜检
(一)真菌小培养
最好在无菌室或接种罩内进行操作。
【材料与方法】
1.用眼科镊子夹取无菌小培养钢环,环的两面分别蘸取融化的固体石蜡,平置于无菌载玻片上,另取一无菌盖玻片,在酒精灯火焰加热后覆盖于钢环上,待冷,小培养钢环即被固定于载玻片和盖玻片之间。
2.用毛细滴管吸取融化之培养基,从钢环上端孔注入,注入量占容积的1/2即可。
3.培养基冷却凝固后,用接种针挑取材料,由上端孔接种于环内培养基上。并用无菌棉花轻轻塞住培养钢环的上端孔和侧孔,以利于空气对流。
4.置湿盒内,室温或37℃培养2~3d后,逐日观察,镜下可连续看到真菌生长过程及菌丝、孢子等的特征。
5.亦可不用小培养钢环,直接将融化的培养基滴于无菌玻片,待冷凝后从周边接种材料,用盖玻片覆盖后培养,亦可以在显微镜下连续观察。
(二)斜面培养
【材料与方法】
1.将接种针尖弯成L型,挑取培养物材料,接种于斜面培养基中间一点上,并稍微插入培养基内。
2.毛发或皮屑等病理材料或其www.lindalemus.com/wsj/他物品材料,先用75%酒精浸泡数分钟后,再以无菌盐水冲洗数遍,置于斜面上,并适当向培养基内压入。
3.置室温或37℃培养,每2~3d观察一次。
【结果】
注意菌落的形态特点及颜色变化。挑取少许用压片观察镜下菌丝和孢子特征,临床材料若3周不长者,可报告阴性。
三、浅部真菌临床标本检查
浅部真菌病,包括毛发、指(趾)的皮肤等多种癣病。一般取患病组织材料直接镜检。
【材料与方法】
1.标本采集 采集病变部位材料。发癣可用镊子拔取病损部位毛发,残断头发,若带有灰白色菌鞘者阳性率高,皮肤癣可用小刀刮皮肤损害部位的边缘,以获得皮屑。甲癣则可用小刀刮患病指(趾)甲,以获得甲屑。取标本时,最好先用新洁尔灭洗涤患部后,再取标本。
2.标本制作 清洁玻片上加10%NaOH或KOH1~2滴,将标本材料置于其中,加盖玻片,于酒精灯火焰上方微微加热,静置3~5min,以溶解角质使标本透明,轻轻挤压盖玻片后,显微镜观察。
【结果】
在镜下若能看到典型的菌丝和孢子,即为阳性,常可确定癣病,必要时可送培养。例如:
1.黄癣病,发内有粗细一致的菌丝与发长轴平行,分散于发内,有时分隔似关节孢子,可有或无气泡。
2.黑癣菌,发内有大量孢子,呈关节型排列并充满整个发内,因此毛发出皮即断。
3.铁锈色小孢子菌,发外有卵圆型小孢子,直径2~3mm,密集成片;在发内(根部)可见少数细菌丝。
4.足癣趾间皮屑,镜检可见到上皮细胞附有细长的有隔菌丝及链状排列的孢子。
【注意事项】
1.观察菌丝和孢子时,应注意与纤维、表皮细胞、气泡及油点等区别。
2.阴性结果,不能完全排除真菌感染,应反复检查几次。