实验十二 厌氧芽胞梭菌
厌氧芽胞梭菌属(Clostridum)中主要致病菌有破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌和艰难梭菌等。
破伤风梭菌(C.tetani)为专性厌氧菌，是破伤风的病原菌。
产气荚膜梭菌(C.perfringens)是气性坏疽的主要病原菌，多与其他病原梭菌混合感染导致气性坏疽；也可污染肉类，引起食物中毒。
肉毒梭菌(C.botulinum)为专性厌氧菌，在厌氧环境中分泌毒性极强烈的外毒素(肉毒毒素)。人类误食被肉毒毒素污染的食物后，将发生以运动神经麻痹为主的肉毒中毒。
（一)形态与培养特性
【材料与方法】
1．破伤风梭菌革兰染色片、产气荚膜梭菌革兰染色片、荚膜染色片、肉毒梭菌革兰染色片。
2．观察破伤风梭菌厌氧血琼脂平板培养物和庖肉培养基厌氧培养物。产气荚膜梭菌厌氧血琼脂平板培养物和24～48h庖肉培养物。肉毒梭菌厌氧血琼脂平板培养物和庖肉培养基厌氧培养物。
【结果】
1．破伤风梭菌为革兰阳性细长杆菌；芽胞正圆形，位于菌体顶端，直径大于菌体，使菌体呈鼓槌状(图12-1)。
图12-1 破伤风杆菌纯培养的镜下形www.lindalemus.com/shiti/态
产气荚膜梭菌为革兰阳性粗大杆菌，两端钝圆，单个或成双排列；芽胞一般少见，芽胞椭圆形，直径小于菌体，位于菌体中央或次极端。从人或动物体内新分离者有荚膜。
肉毒梭菌为革兰阳性粗短杆菌；芽胞椭圆形，粗于菌体，位于次极端，使细菌呈汤匙状或网球拍状。
2．破伤风梭菌在厌氧血琼脂平板上形成较大(2～4mm)、扁平、边缘不齐的菌落，有狭窄的β溶血环。部分菌落呈羽毛状。
产气荚膜梭菌在厌氧血琼脂平板上形成较大(2～4mm)、圆形、光滑、边缘整齐的菌落，多数菌株有双层溶血环，内环完全溶血，外环不完全溶血。
肉毒梭菌在厌氧血琼脂平板上形成较大(2～6mm)、不规则、半透明、灰白色的菌落，有β溶血环。
3．破伤风梭菌在庖肉培养基中生长缓慢，厌氧培养2～7d，肉渣部分消化，微变黑，有少量气体。
产气荚膜梭菌在庖肉培养基中呈混浊生长，肉渣呈淡粉红色，不被消化，产生大量气体。
肉毒梭菌在庖肉培养基中生长旺盛，呈均匀混浊，肉渣被消化变黑色，有腐败恶臭。
（二)汹涌发酵试验
【材料与方法】
穿刺接种产气荚膜梭菌于牛乳培养基，37℃厌氧培养18～24h，观察结果。
【结果】
产气荚膜梭菌能分解牛乳中的乳糖，产酸，使酪蛋白凝固，同时产生大量气体，冲散凝固的酪蛋白，因此牛乳管中可看到凝固的蛋白和冲至管顶部的凡士林；这种气势凶猛的现象，一般培养6h后即可发生，称“汹涌发酵”。此为鉴别本菌的特征之一。
附录：
（一)溴甲酚紫牛乳培养基
成分：新鲜牛乳，1.6%溴甲酚紫酒精溶液。
制法：将新鲜牛乳分装于沉淀管中，2000rpm离心15min。用虹吸管吸出乳汁，注入三角烧瓶中，除去乳脂。每1000ml牛乳加入溴甲酚紫1ml，分装试管，间歇灭菌：第1日75℃30min，第2日80℃ 30min，第3日85℃30min，再于37℃www.med126.com中经24～48h，无菌生长方可使用。
（二)肉渣培养基
制法：将制肉浸液剩下的肉渣装入试管，每支2～3g。然后加入pH7.6的肉浸液约5ml，121℃ 30min 灭菌后备用。
（三)葡萄糖高层琼脂培养基
成分：
牛肉膏 3g
蛋白胨 10g
氯化钠 5g
葡萄糖 3～5g
琼 脂 18～20g
水 1000ml
制法：上述各成分混合溶化后，121℃20min灭菌后，分装于无菌试管，每支试管装入的培养基需超过试管高度的3/5，经37℃24～48h 孵育后若无菌生长即可使用，使用时加热融化高层琼脂，冷至45℃左右，种入厌氧菌，迅速混匀。冷凝后37℃孵育，厌氧菌在管底处生长。
